靶向CD19和CD81的双靶点嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本技术涉及肿瘤免疫，特别涉及一种靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体-t细胞(chimeric antigen receptor-t cell，car-t)是指经基因修饰后，能以主要组织相容性复合体(mhc)非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的t细胞。大量研究表明，car-t细胞可以有效地识别特异的肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。car-t细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式，被用于治疗血液癌症和多种实体瘤，特别是针对b细胞系恶性血液肿瘤(包括：非霍奇金淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病、b细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大b细胞淋巴瘤等)的cd19 car-t疗法在临床上展现出非常好的治疗效果，完全缓解率可以高达80％以上。

2、嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件。cd19是一种b细胞表面的95kda的糖蛋白，从b细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。cd19是免疫球蛋白(ig)超家族的成员之一，作为b细胞表面信号传导复合物的组成元素之一，参与调控了b细胞受体的信号传导过程。通常认为，cd19的表达只限于b细胞系(b-cell lineage)，cd19不会表达于除b细胞外的正常细胞表面，包括多能造血干细胞。cd19还表达于大多数b细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和一部分急性髓性白血病等细胞的表面。因此，在对白血病或淋巴瘤的治疗中，cd19是一种非常有价值的安全好的免疫治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗cd19的抗体及其单链抗体片段(scfv)，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。

3、目标抗原的选择对于嵌合抗原受体(car)的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性等都是关键的决定因素。自1998年car-t靶点相关研究的出现，关于新靶点的探索从未间断，新靶点的开发在car-t细胞治疗技术领域是最重要的环节之一。目前，用于治疗b细胞淋巴瘤的car-t药物除了传统的cd19-car-t外，cd20作为car-t靶点也已应用于治疗非霍奇金淋巴瘤及慢性淋巴细胞白血病。

4、然而，接受单靶点cd19-car-t细胞治疗后的患者中，多达三分之二的患者会出现因cd19低表达或丢失而出现癌症复发的情况。因此，有待于构建可以同时靶向双靶点的双特异性car-t，以期望降低肿瘤细胞的免疫逃逸，降低复发率。

技术实现思路

1、基于此，本技术提供一种靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体及其应用。该靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体可用于制备靶向cd19和cd81双靶点的双特异性car-t。与cd19-car-t相比，该双特异性car-t可具有基本相当或更强的抗肿瘤活性，降低或避免单靶点转阴或抗原低表达的阳性肿瘤细胞产生的免疫逃逸，降低复发风险。

2、在本技术的第一方面，提供一种靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体，其包括靶向cd19的抗原结合结构域和靶向cd81的抗原结合结构域；

3、其中，所述靶向cd19的抗原结合结构域包括氨基酸序列依次如seq id no.1中第24～34位、第50～56位、第89～97位所示的轻链互补决定区scfv1-l-cdr1、scfv1-l-cdr2和scfv1-l-cdr3，还包括氨基酸序列依次如seq id no.2中第31～35位、第50～65位和第98～109位所示的重链互补决定区scfv1-h-cdr1、scfv1-h-cdr2和scfv1-h-cdr3；

4、所述靶向cd81的抗原结合结构域包括氨基酸序列依次如seq id no.3中第24～40位、第56～62位以及第95～102位所示的轻链互补决定区scfv2-l-cdr1、scfv2-l-cdr2和scfv2-l-cdr3，还包括氨基酸序列依次如seq id no.4中第31～35位、第50～66位和第99～108位所示的重链互补决定区scfv2-h-cdr1、scfv2-h-cdr2和scfv2-h-cdr3。

5、在一些实施方式中，所述靶向cd19的抗原结合结构域包括氨基酸序列如seq idno.1所示的轻链可变区和氨基酸序列如seq id no.2所示的重链可变区；

6、所述靶向cd81的抗原结合结构域包括氨基酸序列如seq id no.3所示的轻链可变区和氨基酸序列如seq id no.4所示的重链可变区。

7、在本技术的第二方面，提供一种核酸，其核苷酸序列包括如下至少一种：

8、第一编码序列，其为本技术第一方面所述的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体的编码序列；和

9、第二编码序列，其为与所述第一编码序列互补的核苷酸序列。

10、在本技术的第三方面，提供一种表达载体，其包括本技术第二方面所述的核酸的核苷酸序列。

11、在本技术的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有如本技术第三方面所述的表达载体，或者，所述宿主细胞的染色体中整合有外源的本技术第二方面所述的核酸。

12、在本技术的第五方面，提供一种car-t细胞，其具有如下特征中的一项或多项：

13、所述car-t细胞表达本技术第一方面所述的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体；

14、所述car-t细胞的基因组中整合有本技术第二方面所述的核酸；

15、所述car-t细胞包括本技术第三方面所述的表达载体。

16、在本技术的第六方面，提供一种car-t细胞的制备方法，可用于制备本技术第五方面所述的car-t细胞，所述的制备方法包括如下步骤：将本技术第一方面所述的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体的编码基因转导入t细胞，获得所述car-t细胞。

17、在本技术的第七方面，提供一种药物组合物，其包括免疫活性组分和药学上可接受的载体；

18、其中，所述免疫活性组分包括本技术第一方面所述的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体、本技术第二方面所述的核酸、本技术第三方面所述的表达载体和本技术第五方面所述的car-t细胞中的至少一种。

19、在本技术的第八方面，提供本技术第一方面所述的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体、本技术第二方面所述的核酸、本技术第三方面所述的表达载体、本技术第四方面所述的宿主细胞、本技术第五方面所述的car-t细胞以及本技术第七方面所述的药物组合物在制备抑制b细胞系恶性肿瘤的制剂或药物中的应用。

20、本技术中所提供的靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体(可记为双特异cd19-cd81-car)不仅能够特异性识别cd19抗原、cd81抗原中任一个单靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别cd19抗原和cd81抗原共同表达的肿瘤细胞，是一种双特异性car-t。

21、本技术构建的双特异cd19-cd81-car载体的car-t细胞可用于同时靶向表达cd19抗原和表达cd81抗原的b细胞系恶性肿瘤。与cd19-car-t相比，该双特异性的car-t可具有基本相当或更强的抗肿瘤活性，具有非常好的肿瘤杀伤效果，可扩大治疗范围，降低或避免单靶点转阴或抗原低表达的阳性肿瘤细胞产生的免疫逃逸，从而降低复发风险，更好地靶向和治疗b细胞系恶性肿瘤。

22、该双特异性的car-t可用于排除由于单靶点转阴导致的肿瘤复发，为更好地靶向治疗b细胞来源的白血病和淋巴瘤奠定基础。