治疗乙型肝炎感染的方法与流程

本技术涉及寡核苷酸及其用途，特别是涉及治疗乙型肝炎感染的用途。

背景技术：

1、慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染是全世界发病率和死亡率的重要原因。当前的hbv疗法(例如核苷类似物)需要终身治疗以降低血浆病毒血症，并且从长远来看通常无效。慢性hbv的功能治愈传统上是最佳的治疗结果。rna干扰(rnai)技术为药理上干预提供了可能性。

2、外包膜蛋白统称为乙型肝炎表面抗原(hbsag)。hbsag由称为s、m和l由重叠的开放阅读框(orf)编码的三个相关的多肽组成。最小的包膜蛋白是具有226个氨基酸的s，称为s-orf。m和l是从上游翻译起始位点产生的，分别向s中添加55和108个氨基酸。hbv s、m和l糖蛋白存在于完整的、传染性hbv病毒体(被称为dane颗粒)的病毒包膜中，并且所有三种产生和分泌过多，形成了慢性hbv患者血液中发现的非感染性亚病毒球形和丝状颗粒(均称为诱饵颗粒)。诱饵颗粒表面的大量hbsag被认为抑制了慢性hbv感染(chb)患者的体液免疫和自发清除。

技术实现思路

1、本公开的方面涉及改进的基于寡核苷酸的组合物和用于治疗受试者中hbv感染的和相关方法。在一些实施方式中，本公开涉及产生持久的hbv表面抗原(hbsag)表达的敲低的有效寡核苷酸的开发。寡核苷酸诱导rna干扰(rnai)介导的mrna的识别和破坏，所述mrna编码肝细胞中所有形式的hbsag。这包括从cccdna和已整合到宿主基因组中的hbv dna两者转录的病毒rna翻译的蛋白。本文提供了寡核苷酸，其被设计为靶向在所有已知基因型上由hbv基因组编码的广泛的hbsag转录物组。在一些实施方式中，已经发现，本文公开的靶向肝细胞中的hbsag转录物的寡核苷酸可以高特异性地产生稳定的hbsag表达降低，其在施用至受试者后持续延长的时间段(例如，大于7周至数月)的(参见例如实施例1和3)。在一些实施方式中，已经发现使用本文公开的寡核苷酸靶向hbsag表达导致前基因组rna(pgrna)和其他病毒生命周期中间体的减少。还发现本文公开的某些rnai寡核苷酸可以敲低源自cccdna或整合病毒的hbsag mrna转录物。在其他方面，已经发现使用本文公开的寡核苷酸靶向hbsag表达降低了所有hbv蛋白(hbx除外)的表达，即hbcag、hbeag和hbv聚合酶，导致hbv核心蛋白的胞质滞留。此外，在一些实施方式中，使用本文提供的方法由mrna敲低导致的清除循环hbsag在临床上是有利的，因为其能够破坏由chb患者中高水平的循环hbsag引起的hbv免疫耐受。重新激活针对hbv感染的免疫系统活性被认为是实现被定义为hbsag的永久血清清除的功能性治愈的基石。

2、先前的工作已经表明，使用靶向多种不同hbv基因(即s、c、p和x基因)或在某些情况下仅靶向x基因转录物的rnai剂的组合可有效抑制hbv复制和基因表达。但是，本文提供的结果表明，仅使用靶向hbsag转录物的rnai寡核苷酸也可以有效抑制hbv复制和基因表达，这为治疗hbv感染提供了一种新的治疗方法。除了沉默病毒rna的直接作用外，hsb-219前体还可以阻止hbv核心抗原(hbcag)的细胞核定位。重要的是，靶向hbv-x或同时靶向两者基因都不能阻止hbcag细胞核定位。临床前数据强烈表明，由靶向s的rnai疗法引起的细胞核核心定位的抑制可显著改善hbsag抑制的持续。值得注意的是，已证明患者体内缺乏hbcag细胞核定位与抗病毒疗法的有利响应相关。

3、本公开的一些方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)mrna的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为19至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含与acaanaauccucacaaua(seq id no:1)所示的hbsag mrna的序列互补的区域。

4、在一些实施方式中，所述寡核苷酸还包含长度为19至50个核苷酸的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区。在一些实施方式中，有义链包含与uunuugugaggauun(seq id no:2)所示的序列互补的区域。在一些实施方式中，有义链包含与5′-uuauugugaggauunuuguc(seq id no:3)所示的序列互补的区域。

5、在一些实施方式中，反义链包含uuauugugaggauunuugucgg(seq id no:4)所示的序列。在一些实施方式中，反义链由uuauugugaggauucuugucgg(seq id no:5)所示的序列组成。在一些实施方式中，反义链由uuauugugaggauuuuugucgg(seq id no:5.1)所示的序列组成。

6、在一些实施方式中，有义链包含acaanaauccucacaauaa(seq id no:6)所示的序列。在一些实施方式中，有义链包含gacaanaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq id no:7)所示的序列。在一些实施方式中，有义链由gacaaaaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq id no:8)所示的序列组成。在一些实施方式中，有义链由gacaagaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq id no:8.1)所示的序列组成。

7、本公开的其他方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)mrna的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中所述有义链包含gacaaaaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq id no:8)所示的序列，其中所述反义链包含uuauugugaggauuuuugucgg(seq id no:5.1)所示的序列，其中所述反义链和所述有义链各自包含一个或多个2'-氟和2'-o-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，并且其中所述有义链与一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分缀合。

8、本文还提供用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)mrna的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：所述有义链包含如下序列：如gacaaaaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq id no:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-o-甲基修饰的核苷酸，以及至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链与一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分缀合；和所述反义链包含如下序列：如uuauugugaggauuuuugucgg(seq id no:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-o-甲基修饰的核苷酸，以及至少三个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。有义链包含在第1位与第2位核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

9、在一些实施方式中，反义链包含在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯键。

10、在一些实施方式中，反义链的所述5’-核苷酸具有以下结构：

11、

12、在一些实施方式中，所述有义链上的–gaaa–序列的一个或多个核苷酸与单价galnac部分缀合。

13、在一些实施方式中，所述有义链上的所述–gaaa–序列的核苷酸各自与单价galnac部分缀合。在一些实施方式中，–gaaa–基序包含以下结构：

14、

15、其中：

16、l代表键、点击化学柄、或长度为1至20个包含端点的、连续的、共价键合的原子的接头，其选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代的和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基及其组合；和

17、x是o、s或n。

18、在一些实施方式中，l是乙缩醛接头。在一些实施方式中，x是o。

19、在一些实施方式中，–gaaa–序列包含以下结构：

20、

21、在一些实施方式中，有义链在其3'端包含s1-l-s2所示的茎环，其中s1是与s2互补，并且其中l在s1和s2之间形成长度为至多6个核苷酸的环。在一些实施方式中，l是四环。在一些实施方式中，l在s1和s2之间形成长度为4个核苷酸的环。在一些实施方式中，l包含gaaa所示的序列。在一些实施方式中，所述茎环的l的至多4个核苷酸各自与单独的galnac缀合。

22、在一些实施方式中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述修饰的核苷酸包括2'-修饰。在一些实施方式中，所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-o-甲基、2'-o-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸的所有核苷酸是修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。

23、在一些实施方式中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与靶向配体缀合。在一些实施方式中，所述靶向配体是n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分。

24、本文还提供了组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和抗衡离子，以及组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。

25、本公开的其他方面提供了降低细胞中乙型肝炎病毒(hbv)表面抗原的表达的方法，所述方法包括将本文所述的寡核苷酸递送至所述细胞。在一些实施方式中，所述细胞是肝细胞。在一些实施方式中，所述细胞是在体内。在一些实施方式中，所述细胞是在体外。

26、本公开的其他方面提供了治疗受试者中乙型肝炎病毒(hbv)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的寡核苷酸或组合物。

27、还提供了治疗受试者中hbv感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向hbsag mrna的rnai寡核苷酸，其中所述rnai寡核苷酸在没有用靶向编码非表面抗原的hbv mrna转录物的rnai寡核苷酸治疗的情况下施用。还提供了治疗受试者中hbv感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向hbsag mrna的rnai寡核苷酸，其中未向所述受试者施用选择性靶向hbxag mrna转录物的rnai寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。

28、本公开的其他方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)mrna的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：

29、所述有义链包含如下序列：如gacaaaaauccucacaauaagcagccgaaaggcugc(seq idno:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-o-甲基修饰的核苷酸，以及在第1位与第2位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链上的–gaaa–序列的核苷酸各自与单价galnac部分缀合，其中所述–gaaa–序列包含以下结构：

30、和

31、所述反义链包含如下序列：如uuauugugaggauuuuugucgg(seq id no:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-o-甲基修饰的核苷酸，以及在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：

32、

33、还提供了包含寡核苷酸的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含na+抗衡离子。

34、还提供了降低细胞中乙型肝炎病毒(hbv)表面抗原的表达的方法，所述方法包括递送寡核苷酸或组合物。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是在体内。在一些实施方式中，细胞是在体外。

35、还提供了治疗受试者中乙型肝炎病毒(hbv)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。