免疫治疗剂的剂量确定的制作方法

本发明涉及用于确定免疫治疗化合物的合适剂量的方法，在相同剂量下所述免疫治疗化合物的有效性和毒性可在个体之间存在显著差别，这是由于个体对象内的天然差异，例如免疫系统响应于施用这种免疫治疗化合物的反应的差。

背景技术：

1、通常，治疗化合物的治疗有效剂量很容易确定。为了确定治疗化合物(例如抗生素或镇痛药)的有效量，将增加量的治疗化合物给予一组对象直至观察到所需的治疗效果，预期剂量越大，则治疗效果越好。然而，限制可给予的治疗化合物剂量的一个因素是在施用更高量但仍是治疗量的化合物时所观察到的不希望的副作用的出现。通过简单地给予越来越大量的化合物直至观察到副作用，例如发烧、恶心或诸如器官衰竭、休克等更严重的影响，也可以容易地确定这样的量或毒性剂量。由于这样的治疗有效和毒性的剂量通常以每千克体重为基础确定，或针对相对于个体的某些其他变量进行归一化，因此对于任何患者，既有效且无毒的治疗化合物的剂量很容易外推。

2、然而，存在这样的情况：使用标准方法无法确定对所有个体的有效治疗和/或毒性剂量和/或它们的外推，例如在治疗剂不满足所施用的量越大所观察到的治疗效果越大的预期的情况下。本发明人观察到，在施用作为toll样受体激动剂的免疫治疗剂的情况下，向不同个体施用相同剂量导致不同的结果，例如，不同水平的治疗效果和/或不同水平的副作用。本发明人还观察到，从不同个体分离的细胞，在通过细胞因子表达所测量的细胞活化方面，对相同量的免疫治疗剂的响应不同。本发明部分基于这些观察结果，这些结果表明免疫治疗剂的免疫反应在个体免疫系统中天然差异，以使得对于所有个体没有保证对特定免疫治疗剂具有可接受治疗效果，并且优选提供可接受的毒性谱的基于每单位基础(例如，重量、表面积)的通用剂量。

技术实现思路

1、本发明涉及用于确定免疫治疗剂的合适剂量的方法，所述免疫治疗剂的量优选对于该个体是治疗性且无毒的。不希望受限于特定机制，认为为了提供治疗效果，免疫治疗剂(例如基于rna的分子)依赖于许多天然因子，这些因子的活性和量在个体之间存在差别，因此导致当相同药剂以相同剂量施用时，在不同个体中观察到不同的效果(治疗性的和不需要的)。

2、特别地，本发明涉及确定用于向个体施用的免疫治疗剂的合适剂量的方法，其包括：(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，以及(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应。在一个实施方案中，步骤(b)的特征在于，定性和/或定量测量至少一种免疫反应，优选定量测量至少一种免疫反应。用于本发明方法的剂量是免疫治疗剂的量。在其他单位系统中，剂量例如可以是以皮克、纳克、微克、毫克和克或其等同物的量。剂量或量可以是绝对量，即剂量不随个体的年龄、性别、体重，反映脂肪组织的量的体重指数、皮肤的表面积等而变化。或者，剂量可以考虑个体之间的差异，例如年龄、性别、体重、反映脂肪组织的量的体重指数、皮肤的表面积等。多种不同剂量代表不同量的单独剂量，优选地，不同的量以相同的方式定量(以相同的单位表示)，例如，所有的多种不同剂量以mg/kg体重为单位或者都是绝对量。在接触多种不同剂量的步骤在体外进行的实施方案中，剂量可以是绝对量或可以考虑免疫反应性物质的类型，例如，在免疫反应性物质包含免疫细胞的情况下，剂量可以考虑免疫细胞的数量或免疫细胞的亚型的数量。

3、出于本发明的目的，可以使用本领域已知的用于使免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触或用于测量免疫反应的任何方法。示例性实施方案包括其中免疫反应性物质是包含从个体分离的免疫细胞(例如从个体分离的全血或经纯化的免疫细胞群)的细胞组合物。在向个体施用多种不同剂量的免疫治疗剂的实施方案中，免疫反应性物质是免疫系统本身，并且测量了由个体体内的免疫细胞产生的免疫反应。例如，在施用免疫治疗剂之后，可以从个体中分离血液或淋巴，并测试所需的免疫反应，例如细胞因子的表达。在向个体施用免疫治疗剂的一个实施方案中，这种施用可以在皮肤上进行，即皮肤划痕或皮肤点刺测试。

4、在一个实施方案中，该方法在体内进行或在体外进行，或者至少一个步骤在体内进行，其他步骤在体外进行，例如，接触步骤在体内进行，通过例如从个体收集血液并测量血液中或从血液中分离的细胞中的免疫反应来测量免疫应答在体外进行。优选地，该方法中的所有步骤均在体外进行。

5、可用于本发明方法的免疫治疗剂是可以改变动物，优选人的免疫系统的至少一种组分的任何药剂、分子、化合物，组合物等。例如，免疫治疗剂可以活化特定类型的免疫细胞或可以使特定类型的免疫细胞静止，所述免疫细胞的活化或静止可以通过例如细胞因子表达的变化来测量。对免疫系统的至少一种组分的另一些作用可包括使免疫细胞增殖或分化，例如使血液中免疫细胞数量增加或减少。此外，免疫治疗剂可以诱导抗体的产生或者可以活化免疫细胞(例如细胞毒性t细胞)以诱导细胞毒性作用。尽管细胞因子表达的变化在如下所述的本发明方法的背景下可用作免疫反应，但在一个实施方案中，鉴于细胞因子产生免疫系统变化(引起免疫反应)的能力，其也可以是免疫治疗剂。以下讨论了可用于本发明方法的示例性免疫反应。

6、在一个实施方案中，免疫治疗剂是这样的化合物，其是toll样受体(toll-likereceptor，tlr)激动剂，例如tlr-1、tlr-2、tlr-3、tlr-4、tlr-5、tlr-6、tlr-7、tlr-8、tlr-9、tlr-10、tlr-11、tlr12或tlr13激动剂。优选地，tlr是位于细胞内的tlr，例如tlr-3、tlr-7、tlr-8和tlr-9。还优选地，免疫治疗剂是toll样受体-7(tlr-7)或toll样受体-8(tlr-8)激动剂。tlr-7激动剂是已知的并且包括以下的化合物：例如单链rna分子和咪唑并喹啉化合物(例如噻唑并喹诺酮)、抗病毒化合物咪喹莫特(imiquimod)和瑞喹莫德(resiquimod)。另一些tlr-7激动剂化合物包括n-(4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-n-(四氢-2h)-吡喃-4-基)乙酰胺、n-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]丁基}-n-(1,1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺、n-(4-(4-氨基-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基)-n-(1,1-二氧代硫杂环丁烷-3-基)乙酰胺、聚(d胸苷)、鸟苷类似物洛索立宾(loxoribine)和溴匹立明(bropirimine)，以及其他核苷酸-碱基类似物。tlr-8激动剂还包括单链rna分子以及2-乙基-1-(4-((2-甲基四氢呋喃-3-基)氨基)丁基)-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺和1-(4-(环己基氨基)丁基)-2-乙基-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺。已经观察到，包含鱼精蛋白和rna的颗粒在被例如浆细胞样树突细胞摄取时可以激活tlr-7，或在被例如单核细胞摄取时可以激活tlr-8(wo 2009/144230)。在一个实施方案中，免疫治疗剂可以是病毒，例如rna病毒。免疫治疗剂优选地可以是核酸分子，例如单链rna分子或其他基于rna的分子，该核酸分子编码免疫反应性肽或蛋白质。更优选地，测量其免疫反应的免疫治疗剂是编码一种或更多种肽的单链rna分子，每种肽包含在病变细胞或组织(例如肿瘤组织)上特异性表达的表位。来自rna的这些肽(免疫反应性肽)的表达导致它们在与mhc分子的复合体中在细胞表面上呈递，并最终诱导针对表达表位的病变细胞或组织的免疫应答。在一个优选的实施方案中，rna分子可以与阳离子脂质、阳离子聚合物和具有正电荷可以与带负电的核酸形成复合体的其他物质络合。以下描述了另外的示例性免疫治疗剂。

7、如本文所用，可用于本发明方法的免疫反应性物质包含当与免疫治疗剂接触时，可以测量某些特征的变化(免疫反应)的个体免疫系统的全部或部分。优选地，免疫反应性物质包含免疫系统的细胞，例如免疫细胞或免疫反应性细胞或包含免疫细胞或免疫反应性细胞的组合物，例如全血或淋巴液。免疫细胞也可以是基本上纯化的，例如纯度为80％、85％、90％、95％、99％。术语“免疫细胞”是指参与保护个体身体的免疫系统的细胞。术语“免疫细胞”包括特定类型的免疫细胞及其前体，包括白细胞(包括巨噬细胞)、单核细胞(巨噬细胞的前体)、粒细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、树突细胞、肥大细胞，和淋巴细胞(例如b细胞、t细胞和自然杀伤(nk)细胞)。巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、嗜中性粒细胞、树突细胞和肥大细胞是吞噬细胞。在一个实施方案中，个体的免疫反应性物质包含从个体的血液中分离的细胞或者免疫反应性物质包含从个体分离的全血或者免疫反应性物质包含从个体分离的淋巴液。在该方法在体外进行的一个实施方案中，个体的免疫反应性物质包含外周血单核细胞(pbmc)或基本上由外周血单核细胞组成，或者在免疫反应性物质是全血的情况下，全血可以任选地补充有树突细胞，例如浆细胞样树突细胞(pdc)和/或单核细胞来源的未成熟树突细胞(idc)。树突细胞可以来自异源或同源，或者可以是自体的，优选自体的。由于免疫治疗剂可以是免疫细胞，因此在本发明的一个实施方案中，免疫反应性物质和免疫治疗剂都可以是免疫细胞。

8、如本文所用，在本发明方法的背景下的免疫反应是免疫系统或免疫系统组分的可测量特征的变化，并且优选是已知表明了归因于施用免疫治疗剂的治疗效果的免疫反应。例如，免疫反应包括免疫细胞活性的变化，该活性可以是免疫细胞的分化表型的变化或免疫细胞的增殖能力的变化，或免疫细胞产生的一种或更多种细胞因子的表达或量在核酸或蛋白质水平上的变化。免疫反应可以是个体中特定类型免疫细胞(例如淋巴细胞或t细胞)的量的变化。免疫反应也可以是个体中血小板计数或血小板活化动力学的变化。免疫反应也可以是个体炎性状态的变化，例如皮肤上的炎性反应，例如接触性皮炎。免疫反应还可包括诱导针对靶抗原的免疫应答，例如诱导针对抗原的细胞毒性t细胞应答。优选地，测量的免疫反应是例如通过检测细胞因子本身或检测编码细胞因子的核酸来测量的免疫细胞所分泌的一种或更多种细胞因子的量/浓度的变化。

9、细胞因子是一类广泛的小蛋白质，其在细胞信号传导中的重要之处在于，它们被细胞释放并影响其他细胞的行为，尽管细胞因子也可能参与自分泌信号传导。细胞因子由广泛的细胞产生，包括广泛的免疫细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和多种基质细胞，并且给定的细胞因子可以由多于一种类型的细胞产生。示例性细胞因子包括单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，例如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-15、il-21、inf-α、inf-γ、gm-csf。在一个实施方案中，细胞因子参与调节淋巴稳态，优选参与和优选诱导或增强t细胞的发育、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白介素。在一个优选的实施方案中，细胞因子是以下的一种或更多种：白介素-6(il-6)、白介素-12(il-12)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-α(ifn-α)例如干扰素-α2a(ifn-α2a)、干扰素-γ(ifn-γ)、干扰素-γ诱导蛋白(ip10)、白介素1-β(il-1β)、白介素2(il-2)、白介素12p70(il-12p70)。

10、白介素1-β(il-1β)是细胞因子白介素1家族的成员，其由作为蛋白质原的活化的巨噬细胞产生，通过胱天蛋白酶1(casp1/ice)将其蛋白水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎性反应的重要调节剂，其参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。发现在中枢神经系统(central nervous system，cns)中通过该细胞因子诱导环氧合酶-2(ptgs2/cox2)有助于炎性疼痛超敏反应。

11、白介素-2(il-2)是调节负责免疫的白血细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性的蛋白质。il-2是对微生物感染的身体自然应答的一部分并区分外来(“非自身”)和“自身”。il-2主要通过其对t细胞的直接作用在免疫系统的关键功能(例如耐受性和免疫性)中具有关键作用。在t细胞成熟的胸腺中，其通过促进某些未成熟t细胞分化为调节性t细胞来预防自身免疫病，所述调节性t细胞抑制在其他情况下致敏以攻击体内正常的健康细胞的其他t细胞。当初始t细胞也被抗原刺激时，il-2还促进t细胞分化成效应t细胞和记忆t细胞，从而帮助身体抵抗感染。

12、白介素6(il-6)既是促炎性细胞因子又是抗炎性肌细胞因子(myokine)，例如在感染期间和创伤(特别是烧伤或导致炎症的其他组织损伤)之后，由t细胞和巨噬细胞分泌以刺激免疫应答。il-6也在抗感染中起作用，因为il-6已经在小鼠中显示出是抵抗肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)所需的。il-6作为抗炎细胞因子的作用是通过其对tnf-α和il-1的抑制作用以及通过il-1ra和il-10的激活来介导的。

13、白介素12(il-12)由响应于抗原刺激的树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和人b成淋巴细胞样细胞天然产生。il-12是由两个独立基因il-12a(p35)和il-12b(p40)编码的异二聚体细胞因子。在蛋白质合成之后形成活性异二聚体(称为'p70')和p40的同二聚体。il-12参与稚t细胞向th1细胞的分化，并且被称为t细胞刺激因子，其可以刺激t细胞的生长和功能。其刺激从t细胞和自然杀伤(nk)细胞产生干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，介导nk细胞和cd8+细胞毒性t淋巴细胞的细胞毒活性的增强，并且还具有抗血管生成活性。

14、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)(恶质素(cachexin)或恶液质素(cachectin))参与全身性炎症，并且是构成急性期反应的细胞因子之一。其主要由活化的巨噬细胞产生，尽管其可以由许多其他细胞类型产生，例如树突细胞、单核细胞、cd4+淋巴细胞、nk细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和神经元。tnf-α的主要作用是调节免疫细胞。作为内源性热原，tnf-α能够诱发发热、凋亡性细胞死亡、恶病质、炎症并能够抑制肿瘤发生和病毒复制，并通过产生il-1和il-6的细胞对脓毒症作出响应。

15、人i型干扰素(ifn)属于干扰素蛋白的大亚组，其有助于调节免疫系统的活性。哺乳动物类型命名为ifn-α(alpha)，ifn-β(beta)，ifn-κ(kappa)，ifn-δ(delta)，ifn-ε(epsilon)，ifn-τ(tau)，ifn-ω(omega)和ifn-ζ(zeta，也称为限制素(limitin))。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫应答。负责它们合成的基因有13种亚型，称为ifna1、ifna2、ifna4、ifna5、ifna6、ifna7、ifna8、ifna10、ifna13、ifna14、ifna16、ifna17、ifna21。这些基因在染色体9上的簇中一起被发现。ifn-β蛋白具有抗病毒活性，其主要参与先天免疫应答。已经描述了两种类型的ifn-β，ifn-β1(ifnb1)和ifn-β3(ifnb3)。ifn-α和ifn-β由许多细胞类型分泌，包括树突细胞、淋巴细胞(nk细胞、b细胞和t细胞)、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞等。它们刺激巨噬细胞和nk细胞二者以引发抗病毒应答，并且还对肿瘤具有活性。浆细胞样树突细胞已经被鉴定为响应于toll样受体(tlr)激活(例如tlr-7、8和/或9)的i型ifn的最有效的生产者，因此被称为天然ifn产生细胞。

16、干扰素γ(ifn-γ)是二聚化的可溶性细胞因子，是ii型干扰素中唯一的成员。ifn-γ对于针对病毒、一些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫是至关重要的。ifn-γ是巨噬细胞的重要激活剂和ii类主要组织相容性复合体(mhc)分子表达的诱导物。异常的ifn-γ表达与许多自身炎性和自身免疫病相关。ifn-γ在免疫系统中的重要性部分源于其能够直接抑制病毒复制，最重要的是源于其的免疫刺激和免疫调节作用。ifn-γ主要由作为先天免疫应答的一部分的巨噬细胞、自然杀伤(nk)和自然杀伤t细胞(nkt)产生，一旦抗原特异性免疫形成，则由cd4+th1和cd8+细胞毒性t淋巴细胞效应t细胞(ctl)产生。

17、干扰素-γ诱导的蛋白质10(ip-10)，也称为c-x-c基序趋化因子10(cxcl10)或小诱导型细胞因子b10，是属于cxc趋化因子家族的小细胞因子，其由数种细胞类型分泌，例如，响应于ifn-γ。这些细胞类型包括巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。ip-10已被归因于数种作用，例如单核细胞/巨噬细胞、t细胞、nk细胞和树突细胞的化学吸引、促进t细胞与内皮细胞的黏附、抗肿瘤活性，以及抑制骨髓集落形成和血管生成。

18、在一个实施方案中，免疫反应的测量涉及使用与分子特异性结合的标记配体，例如与核酸杂交的标记核酸探针和/或与肽(例如细胞因子)特异性结合的标记抗体或其片段/衍生物。

19、根据本发明，可以使用已知的核酸检测方法，例如涉及杂交或核酸扩增技术的方法，来测量核酸的存在或量。在一个实施方案中，使用rt-pcr或northern印迹分析来检测mrna转录物或确定其量。此类核酸检测方法可涉及使用与核酸杂交的寡核苷酸。合适的寡核苷酸的长度通常在5至数百个核苷酸中变化，更通常长度为约20至70个核苷酸或更短，甚至更通常长度为约10至30个核苷酸。

20、根据本发明，测量肽(例如细胞因子)的存在或量可以以多种方式进行，包括但不限于使用与肽特异性结合的抗体进行免疫检测。使用抗体检测肽的方法是公知的，包括elisa、竞争性结合测定等。通常，此类测定使用特异性结合肽的抗体或抗体片段，所述肽直接或间接与提供用于检测的标记结合，例如，指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。

21、根据本发明，在通过测量细胞生长或其缺乏或细胞分化状态的变化来检测免疫反应的情况下，这种测量可以以多种方式进行，包括但不限于细胞数量的计数，或测量摄入至细胞dna内的3h以确定细胞增殖。可以通过观察与特定分化状态相关的细胞蛋白质的表达变化或通过观察与特定分化状态相关的细胞的视觉表型的变化来测量分化的变化。另外的方法是本领域已知的，并且可以容易地用于本文的方法中。

22、在该方法的一个实施方案中，测量至少一种免疫反应，或者测量两种或更多种免疫反应，或者测量三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种免疫反应。

23、在该方法的某些实施方案中，多种不同剂量的免疫治疗剂可以是两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的剂量。此外，多种不同剂量的免疫治疗剂可代表剂量递增，优选线性或对数剂量递增，例如1、2、3、4、5等，或1、3、9、27、81、243等，或0.1、1、10、100、1000等。在一个实施方案中，依次进行步骤(a)和(b)。优选地，步骤(b)在步骤(a)之后2至48小时进行，优选在步骤(a)之后4至24小时进行。

24、在一个优选的实施方案中，该方法的步骤(a)(分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触)在体内进行，其特征在于，在单独的施用步骤中使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质分别接触，每个单独的施用步骤的特征在于，向个体施用一种剂量的免疫治疗剂。单独的施用步骤可以相继进行，并且彼此分开2至30天，例如7至28天的时间间隔，优选相隔7天、14天、21天或28天，更优选相隔7天或14天。优选地，在每个单独的施用步骤之后分别进行对至少一种免疫反应的测量。在一个实施方案中，单独的施用步骤可以在基本相同的时间进行，例如，通过在基本相同的时间向皮肤施用多种不同剂量。在该实施方案中，测量的免疫反应例如可以是可目视检测的接触性皮炎。

25、已经向患者提供了许多类型的免疫治疗剂以提供治疗效果，并且鉴于这些知识，提供了治疗效果的这些类型的免疫治疗剂的标准剂量或标准剂量范围是已知的。在已知这样的标准剂量或剂量范围的情况下，步骤(a)中的接触的多种不同剂量优选包括低于标准剂量或范围的剂量，和/或在标准剂量范围内的剂量，和/或高于标准剂量或范围的剂量。例如，在作为癌症疫苗给予个体的rna分子的标准剂量范围为5至100μg的情况下，那么步骤(a)中示例性的接触的多种不同剂量可以是2μg、10μg和150μg。在特定类型的免疫治疗剂的标准剂量或剂量范围未知的情况下，相似类型的免疫治疗剂的已知剂量或剂量范围可用于本发明的方法，或者标准剂量或剂量范围可以用经验确定然后根据本发明应用以确定对于个体的免疫治疗剂的合适剂量。

26、在一个实施方案中，多种不同剂量包含至少一种低于免疫治疗剂的标准剂量范围的剂量。在一个实施方案中，多种不同剂量包含位于免疫治疗剂的标准剂量范围内的至少一种剂量。在一个实施方案中，第一个单独的施用步骤的特征在于，施用低于免疫治疗剂的标准剂量的剂量的免疫治疗剂，并且其中在后续的单独施用步骤中施用的剂量任选地高于在第一个单独施用步骤中施用的剂量。

27、在接触步骤在体外进行的一个实施方案中，免疫治疗剂的标准剂量或剂量范围是已知等于同一免疫治疗剂在体内的标准剂量的剂量或剂量范围。这种等同性是本领域已知的，或者可以使用本领域已知的方法确定。在一个实施方案中，标准剂量可以与体内施用(接触)时的标准剂量相同，但是例如通过与体内接触相比体外使用的免疫反应性物质的量(例如，免疫细胞的数量)和/或通过免疫反应性物质的体积来调整。在一个实施方案中，体外接触的标准剂量与在向个体施用已知标准剂量时在个体中观察到的每毫升血液或淋巴或每个数量的特定类型的免疫细胞的免疫治疗剂的量/浓度相同。在一个实施方案中，标准“体外”剂量等于在向个体施用标准“体内”剂量时在全血中实现的免疫治疗剂的浓度。例如，当1mg/kg的标准剂量导致全血中免疫治疗剂浓度为10μg/ml时，那么在免疫反应性物质是全血的情况下，1mg/kg体内标准剂量的体外等同标准剂量为10μg/ml。

28、本发明的方法还可包括检测至少一种不需要的反应的存在或不存在的步骤，所述不需要的反应例如不需要的免疫反应，例如细胞因子的过高或过低水平的表达；或副作用或不利事件或反应，例如由免疫治疗剂与免疫反应性物质接触引起的器官毒性，例如，由向个体施用免疫治疗剂所引起的。该步骤可以在免疫治疗剂与免疫反应性物质接触的每个步骤之后进行，无论在体外还是体内。在一个实施方案中，在待实现的治疗效果是降低特定类型细胞的量的情况下，不需要的反应可以提高细胞因子的表达，已知该提高的表达会降低免疫治疗剂的治疗能力。副作用是不需要的反应的子集，其可以在体内进行接触步骤时检测到，并且是那些反映个体的一定程度的不适的不需要的反应，其可以在严重程度上有差别。更严重的副作用在本文中称为不可耐受的副作用。示例性的副作用包括但不限于感觉异常、疲劳、头痛、肌肉疼痛、胸部压力或胸部疼痛、战栗、温度升高或发热、耳鸣、关节疼痛、头晕、发汗、张力过低(hypotonia)和/或心动过速。示例性的不可耐受性副作用可以是对个体具有生命威胁的那些，例如最终可导致器官衰竭的全身性炎性应答综合征。

29、在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的情况下，所有后续剂量可以与至少一种抗毒性剂(antitoxic agent)一起施用。在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的一种后检测到至少一种不可耐受的副作用的情况下，所有后续剂量将与至少一种抗毒性剂一起施用。后续剂量可以等于或低于引起可耐受或不可耐受的副作用而引发施用至少一种抗毒性剂的剂量。如果剂量在不存在抗毒性剂的情况下引起可耐受或不可耐受的副作用，但在抗毒性剂存在下施用时可以耐受，则随后的剂量可以更高但仅可在抗毒性剂存在下施用。抗毒性剂优选为解热药，例如nsaid，例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利；阿司匹林及相关的水杨酸盐、例如水杨酸胆碱盐、水杨酸镁和水杨酸钠；对乙酰氨基酚(醋氨酚)；安乃近；萘丁美酮；和非那宗。

30、在施用不与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量等于或小于在先前施用步骤中施用的剂量。优选地，在至少一种不需要的反应是不可耐受的副作用的情况下，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量小于在先前施用步骤中施用的剂量。紧接着先前施用步骤之后的后续施用步骤之后可以进一步进行一个或更多个另外的施用步骤，其任选地代表步骤之间的剂量递增方案。

31、在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，待随后施用的免疫治疗剂的下一个剂量小于在先前施用步骤中施用的剂量。

32、在一个实施方案中，在施用多种不同剂量中的任一种后没有检测到副作用的情况下，这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：至少一种免疫反应表明可接受治疗效果。在确定多于一种剂量为合适剂量的实施方案中，至少一种免疫反应提供可接受治疗效果的最强指示的剂量是向个体施用的免疫治疗剂的剂量。可接受治疗效果的最强指示将取决于所测量的免疫反应。例如，最强指示可以是在施用的多种不同剂量中观察到细胞因子的表达最高或最低的情况。施用的提供可接受治疗效果的最高剂量不一定是提供可接受治疗效果的最强指示的相同剂量。

33、在施用多种不同剂量中的任一种后检测到至少一种副作用的实施方案中，这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：在后续施用步骤中与至少一种抗毒性剂一起施用，并且至少一种免疫反应指示对免疫治疗剂具有可接受治疗效果。在该实施方案的一个方面，在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的任一种后没有检测到副作用的情况下，至少一种免疫反应提供可接受治疗效果的最强指示的剂量是用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。该方面涉及存在多种不同剂量作为合适剂量的情况，因为在与抗毒性剂一起施用的这些剂量下没有检测到副作用。可接受治疗效果的最强指示将取决于所测量的免疫反应。例如，最强指示可以是在与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中观察到细胞因子的表达最高或最低的情况。与至少一种抗毒性剂一起施用的最高剂量(其中未检测到副作用)不一定是提供可接受治疗效果的最强指示的相同剂量。在该实施方案的另一个方面，在施用与至少一种抗毒性剂一起施用的多种不同剂量中的任一种后检测到至少一种副作用的情况下，未检测到副作用或副作用最不严重或在其他方面根据疾病的严重程度被认为是可接受的最高剂量是用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。该方面涉及这样的情况，其中与至少一种抗毒性剂一起施用的一些剂量导致副作用或在与至少一种抗毒性剂一起施用的所有剂量下检测到副作用。因此，合适的剂量是治疗有效的并且未检测到副作用或副作用最不严重或副作用在其他方面根据疾病的严重程度被认为是可接受的剂量。

34、根据本发明，确定为特定个体的特定免疫治疗剂的合适剂量的剂量是这样的剂量，其中这样的剂量反映了用于向个体施用免疫治疗剂的合适剂量：已知至少一种免疫反应在个体中表明对于该免疫治疗剂的可接受的(优选最佳的)治疗效果。优选地，合适剂量还导致个体中不需要的反应最少或副作用最小，无论是否与至少一种抗毒性剂一起施用。在免疫治疗剂与免疫反应性物质在体内接触的实施方案中，至少一种免疫反应表明可接受治疗效果的剂量直接反映了合适的剂量，即，向个体施用免疫治疗剂的合适剂量和与免疫反应性物质接触的多种不同剂量中的一种或更多种相同或相似。在免疫治疗剂与免疫反应性物质在体外接触的实施方案中，体外方法中使用的多种不同剂量不一定与向个体施用可提供可接受治疗效果的剂量相同。因此，其中至少一种免疫反应表明体外可接受治疗效果的剂量可间接反映出合适剂量。在体外接触的剂量与其等同的体内剂量之间的关系是已知的或可以使用本领域已知的方法确定。例如，在体外接触的免疫治疗剂的剂量是相对于接触的免疫细胞数量的量(例如，10ng/108个细胞)的情况下，等同的体内剂量是相对于相同数量的相同免疫细胞导致血液中相同或相似量的免疫治疗剂的剂量(10ng/108个相同细胞)。

35、治疗效果将取决于预期由免疫治疗剂提供的治疗效果。在一个实施方案中，可接受治疗效果包括但不限于阻止或减缓疾病的进展；抑制或减缓个体新疾病的发展；降低目前患有或先前患有疾病的个体中的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即提高)个体的寿命。在一个实施方案中，示例性的最佳治疗效果是已经消除疾病使得不需要进一步治疗的效果。在疾病是癌症的实施方案中，可接受治疗效果是至少肿瘤的尺寸和/或数量不增加的效果，优选是肿瘤的尺寸和/或数量降低的效果，并且最佳的治疗效果是任何和所有肿瘤完全消失，并且不需要进一步施用免疫治疗剂。

36、在已经确定至少一种免疫反应或至少一种免疫反应的特定变化表明可接受治疗效果的情况下，导致相同反应或其变化的剂量表明该剂量是用于提供可接受治疗效果的合适剂量。此外，至少一种免疫反应的强弱或其变化也可表明该剂量下治疗效果的强弱。至少一种免疫反应与许多免疫治疗剂的治疗效果之间的相关性是已知的。此外，可以使用本领域已知的方法确定这种相关性。例如，可以在一个或更多个已经施用免疫治疗剂的个体中测量至少一种免疫反应，所述免疫治疗剂的剂量导致治疗效果，优选导致可接受治疗效果，并且在个体中一致观察到的至少一种免疫反应表明该免疫治疗剂的治疗效果，优选可接受治疗效果。例如，在免疫治疗剂的剂量导致可接受治疗效果始终与三种不同细胞因子的表达提高和某种类型的免疫细胞分化成更成熟的免疫细胞相关的情况下，三种不同细胞因子的表达提高和免疫细胞的分化是指示可接受治疗效果的免疫反应。以这种方式，可以确定指示针对任何免疫治疗剂的治疗效果的免疫反应组或“参数组”。在本发明的一个实施方案中，表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果的已知免疫反应组与在施用一定剂量的免疫治疗剂的个体中所观察到的相同或基本相同，所施用的剂量反映了向个体施用免疫治疗剂的合适剂量。

37、本发明的一些示例性实施方案包括但不限于：(i)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由特定细胞因子的最高表达水平来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致该特定细胞因子的最高表达水平的剂量反映，或(ii)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由特定细胞因子的最低表达水平来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致该特定细胞因子的最低表达水平的剂量反映，或(iii)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导特定细胞因子的表达来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致诱导该特定细胞因子表达的剂量反映，或(iv)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由多种细胞因子的特定表达模式所表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致多种细胞因子的基本相同的特异性表达模式的剂量反映，或(v)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导特定免疫细胞的分化来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致特定免疫细胞的分化的相同或相似的诱导的剂量反映，或(vi)在已知针对特定免疫治疗剂的可接受治疗效果由诱导或增强免疫细胞(例如t细胞)的效应功能来表明的情况下，用于个体的合适剂量通过导致免疫细胞的效应功能的相同或相似的诱导或增强的剂量反映。

38、本发明还涉及用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法，其包括向个体施用一定剂量的免疫治疗剂，所述剂量已根据本发明的方法确定为合适的。优选地，免疫治疗剂是tlr激动剂。在一个实施方案中，用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法包括(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应，其中这样的剂量反映了用于向个体施用的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果，以及(c)以合适剂量向个体施用免疫治疗剂。在一个实施方案中，用合适剂量的免疫治疗剂治疗个体的方法包括以合适剂量向个体施用免疫治疗剂，其中合适剂量通过以下步骤来确定：(a)分别使多种不同剂量的免疫治疗剂与个体的免疫反应性物质接触，和(b)测量由多种不同剂量的免疫治疗剂引起的至少一种免疫反应，其中这样的剂量反映了用于向个体施用的合适剂量：所述至少一种免疫反应表明对免疫治疗剂具有可接受治疗效果。

39、在一个实施方案中，免疫治疗剂的合适剂量与至少一种抗毒性剂一起施用。在该实施方案中，免疫治疗剂的合适剂量是在不施用至少一种抗毒性剂的情况下检测到至少一种副作用的剂量。

40、在一个优选的实施方案中，该方法是用于治疗癌症的免疫治疗方法，并且免疫治疗剂是核酸，优选编码在癌细胞上特异性表达的一个或更多个表位的单链rna。优选地，一个或更多个表位是新表位。

41、从以下发明详述和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得明显。