一种金刚烷胺半抗原、人工抗原、抗体及其免疫亲和柱的应用的制作方法

本发明属于兽药残留检测。更具体地，涉及一种金刚烷胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其免疫亲和柱应用。

背景技术：

1、金刚烷胺作为一类抗流感病毒药物，被非法用于畜禽养殖业，若被非法滥用则易导致个体产生抗药性甚至导致病毒产生变异，对人体产生危害，第560号公告中明确规定金刚烷胺不得用于食品动物，金刚烷胺的使用量和使用频率逐年攀升，药物残留问题也越来越受到人们的重视。而提供一种检测特异性好、灵敏度高的检测金刚烷胺的产品和方法，可以对金刚烷胺的药物残留进行监测，避免因摄入过多金刚烷胺给健康带来损害。

2、目前检测金刚烷胺残留的主要方法有气相色谱(gc)、液相色谱(lc)以及气相色谱和质谱联用等，此类方法的不足之处在于其检测金刚烷胺时需要特定的仪器，对仪器的要求较高，且样本前处理和测定过程的操作繁琐，需要专业人员操作，不适于大量样本的批量检测。酶联免疫吸附法(elisa)、胶体金免疫层析法(gica)、化学发光免疫分析法(clia)和荧光偏振免疫分析法(fpia)等免疫学检测法因其价格低廉、操作简便、检测快速、特异性高等优势，被应用于畜禽类兽药残留的现场大样本初筛检测。

3、酶联免疫吸附法(elisa)和胶体金免疫层析法(gica)是目前兽药残留筛查的主流快检技术，虽然两种免疫分析方法具有诸多优点，但是也容易受样品基质干扰。免疫亲和柱(immunoaffinity column，iac)是目前最高效的纯化技术之一，其原理是以抗原抗体的特异性结合反应和固相萃取技术作为基础，将抗体固定在层析柱上，使样品中的待测物(抗原)与抗体进行特异性结合而被吸附，然后进行洗脱，使抗原解离。该技术可从复杂的混合物中高效地去除干扰物，提高目标分子的纯度和检测灵敏度，洗脱下来的抗原可用液相色谱法或者免疫分析法等进行定量分析，在生物医药研究、临床诊断和制药工业中得到广泛应用。目前畜禽产品兽药检测中，样品基质干扰是影响产品灵敏度和回收率的重要因素，因此有必要制备相应的免疫亲柱高效去除样品干扰物质，从而提高产品的可靠性和准确性。

4、专利cn111253283a披露了一种金刚烷胺半抗原、抗原及其化学发光酶联免疫检测试剂盒，检出限可达0.20μg/l，但是对类似物金刚乙胺交叉反应率高达80.35％。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题克服现有检测金刚烷胺方法的不足，排除样品中的干扰物质，提高检测灵敏度和准确性，提供一种金刚烷胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其免疫亲和柱应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种金刚烷胺半抗原。

3、本发明的第二个目的是提供上述金刚烷胺半抗原的制备方法。

4、本发明的第三个目的是提供所述金刚烷胺半抗原在制备金刚烷胺人工抗原中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种金刚烷胺人工抗原。

6、本发明的第五个目的是提供所述人工抗原在制备金刚烷胺人工抗体中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种金刚烷胺的特异性抗体。

8、本发明的第七个目的是提供一种基于酶联免疫检测金刚烷胺的免疫原与包被原的组合物。

9、本发明的第八个目的是提供所述金刚烷胺半抗原、所述金刚烷胺人工抗原、所述特异性抗体或所述组合物在制备金刚烷胺检测产品中的应用。

10、本发明的第九个目的是提供一种基于金刚烷胺抗体的免疫亲和柱。

11、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

12、本发明提供了一种金刚烷胺半抗原，其结构式如式(i)所示：

13、

14、本发明还提供了式(i)所示金刚烷胺半抗原的制备方法，所述半抗原是通过将金刚烷胺上的氨基功能团作为延长手臂，先与溴乙醛反应，再与羧甲基羟胺半盐酸盐发生反应得到。

15、作为一种可选择的实施方案，所述金刚烷胺半抗原的制备方法包括以下步骤：

16、s1.按摩尔比1:(1～2):(1～5)分别称取金刚烷胺，k2co3和溴乙醛溶解于n,n-二甲基甲酰胺溶液中反应；反应完成后加入冰水，用hcl调节ph至3～5，加入乙酸乙酯进行萃取，用乙酸乙酯层进行点薄层层析硅胶板分析，用饱和nacl水洗涤，用无水na2so4除水，旋干得到棕黄色油状物；将所得棕黄色油状物经硅胶柱层析法纯化，旋干洗脱剂得到产物ama-1；

17、s2.按摩尔比1:(1～3)分别称取步骤s1制备所得ama-1和k2co3，加入无水甲醇溶解，得黄色溶液；添加羧甲基羟胺半盐酸盐到所得黄色溶液中反应，反应完成后除去溶剂，加入水和乙酸乙酯进行萃取，用乙酸乙酯层进行点薄层层析硅胶板分析，用无水na2so4除水，旋干得到淡黄色油状物；将所得淡黄色油状物经硅胶柱层析法纯化，旋干洗脱剂即得金刚烷胺半抗原。

18、本发明制备所得金刚烷胺半抗原与金刚烷胺的骨架结构重叠度高，用其制备的人工抗原可以将金刚烷胺的特征结构暴露出来，使免疫所得的金刚烷胺人工抗体具有良好的特异性和灵敏度。因此，本发明请求保护式(i)所示金刚烷胺在制备金刚烷胺人工抗原中的应用。

19、本发明还提供了一种金刚烷胺人工抗原，所述人工抗原是将式(i)所示金刚烷胺半抗原与载体蛋白偶联得到，所述人工抗原的结构式如式(ii)所示：

20、

21、具体地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或血蓝蛋白。

22、本发明利用制备所得金刚烷胺人工抗原免疫小鼠发现，所免疫的所有小鼠均可以产生鼠多抗，所得抗血清对目标分析物金刚烷胺有抑制效果。因此，本发明还申请保护式(ii)所示金刚烷胺人工抗原在制备金刚烷胺抗体中的应用。

23、本发明提供一种金刚烷胺的特异性抗体，所述抗体是利用所述人工抗原制备得到的多克隆抗体和/或单克隆抗体和/或重组抗体。

24、本发明还提供了一种基于酶联免疫检测金刚烷胺的免疫原与包被原的组合物，所述免疫原为式(i)所示金刚烷胺半抗原与血蓝蛋白的偶联物，所述包被原为式(i)所示金刚烷胺半抗原与牛血清白蛋白的偶联物；所述包被原为式(i)所示金刚烷胺半抗原与血蓝蛋白的偶联物，所述免疫原为式(i)所示金刚烷胺半抗原与牛血清白蛋白的偶联物。

25、本发明还请求保护式(i)所示金刚烷胺半抗原、式(ii)所示金刚烷胺人工抗原、所述特异性抗体或所述组合物在制备金刚烷胺检测产品中的应用。

26、本发明提供一种基于金刚烷胺抗体的免疫亲和柱，利用上述抗体与溴化氢活化的琼脂糖干粉进行偶联、封闭、装柱后制得所述免疫亲和柱。

27、优选地，所述抗体为单克隆抗体。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明提供了一种金刚烷胺半抗原、人工抗原、单克隆抗体及其应用。本发明所述金刚烷胺半抗原与金刚烷胺的骨架结构重叠度高，用其制备的人工抗原可以将金刚烷胺的特征结构暴露出来，使免疫所得的金刚烷胺单克隆抗体抗体具有良好的特异性和灵敏度，对金刚烷胺的最低检测限为0.018ng/ml，ic50为0.297ng/ml，线性范围为0.050～1.753ng/ml，与金刚烷胺的类似物均无交叉反应(对最接近的类似物金刚乙胺，交叉反应率也小于0.03％)，可高特异性识别金刚烷胺，可用于金刚烷胺残留的市场监测和现场监控。该抗体制备的金刚烷胺免疫亲和柱偶联率强，洗脱率好，可重复性高，可有效提高样品在elisa和胶体金免疫检测中的检测效率与准确性，减少基质中的杂质干扰，增加了检测结果的可靠性，应用前景广泛。