高产红景天苷的酿酒酵母基因工程菌、方法及应用

本发明属于基因工程与发酵工程，具体涉及一种高产红景天苷的酿酒酵母基因工程菌、方法及应用。

背景技术：

1、红景天(rhodiola rosea l.)是多年生草本植物，主要生长在干燥、紫外线照射强、昼夜温差大的高海拔地区。红景天可作药用，能够补气清肺，益智养心；也可食用或用作护肤品。红景天苷(salidroside)是红景天植物的有效成分之一，具有预防肿瘤、增强免疫力、延缓衰老、抗疲劳、抗缺氧、防辐射和修复机体等作用。

2、红景天苷传统的获取方法是从红景天植物中提取的，但是红景天生长缓慢，产量低；且传统方法在提取过程中需要用到酸碱等化学试剂，不仅生产成本高，还会对环境造成破坏。随着人们对红景天苷的需求日益增长，从红景天植物中提取的红景天苷的方法已满足不了市场需求。近年来，随着合成生物学技术的蓬勃发展，越来越多的天然药物被人们利用合成生物学技术构建基因工程菌合成出来，极大的增加了生产效率，降低了生产成本，同时保护了生态环境。

3、现有技术中，部分文献或专利报道了以酪醇为底物生物合成红景天苷的方法，然而现有的合成方法多存在udpg供应不足、发酵时间长、酪醇的转化率不高等问题，导致无论是体外催化还是体内催化红景天苷的产量都不高，难以突破10g/l。例如，公开号为cn109988722b的发明专利报道了一种生产红景天苷的重组酿酒酵母菌株，该发明将酪醇和/或红景天苷的生物合成途径中五个关键酶编码基因，包括arol基因、pcaas基因、atugt85a1基因、aro4*基因和aro7*基因导入酿酒酵母中，使这些基因在酿酒酵母中进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇和红景天苷的生物合成。该方法下红景天苷产量为227mg/l。又比如，公开号为cn104946575b的发明专利报道了一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用，其通过引入udp葡萄糖基转移酶，将红景天苷与酪醇的生物合成途径有机地结合在一起，红景天苷的产量为50mg/l。

4、在已公开的专利和文章中，产量最高的是公开号为cn115216504a的发明专利，其报道了一种红景天苷的发酵转化方法，具体包括利用重组大肠杆菌培养菌体后离心收集菌体，再转移到以酪醇和葡萄糖为底物的反应液中进行酶催化产红景天苷，酪醇转化率80％，红景天苷产量9206mg/l。该反应非一步合成，不仅存在步骤复杂易染菌的问题，还存在培养温度高、培养基价格贵、反应时间长和酪醇转化率不高等缺点，同时该发明没能解决udpg供应不足的问题，导致整体成本比较高。

5、因此，有必要对红景天苷的合成展开更深入的研究，以期解决现有技术所存在的udpg供应不足、发酵时间长、酪醇转化率低、红景天苷产量低等问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种高产红景天苷的酿酒酵母基因工程菌，该酿酒酵母基因工程菌携带wwrrugt33糖苷化酶突变体和蔗糖合酶gmsus，为后续生物合成红景天苷提供了支持。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、高产红景天苷的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌携带wwrrugt33糖苷化酶突变体基因和蔗糖合酶gmsus基因；所述wwrrugt33糖苷化酶突变体基因的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述蔗糖合酶gmsus基因的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明利用定向突变的wwrrugt33糖苷化酶和来源于大豆的蔗糖合酶gmsus获得酿酒酵母基因工程菌。wwrrugt33糖苷化酶具有高催化活性，蔗糖合酶gmsus可利用蔗糖和udp(尿苷二磷酸)作为底物产生udpg(尿苷二磷酸葡萄糖)，对红景天苷的高效发酵生产具有重要意义。

5、进一步，编码所述wwrrugt33糖苷化酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，编码所述蔗糖合酶gmsus基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、进一步，所述wwrrugt33糖苷化酶突变体是将rrugt33糖苷化酶第14位的精氨酸突变为甘氨酸，以及第470位的谷氨酸突变为色氨酸而得到。

7、进一步，所述蔗糖合酶gmsus来源于大豆。

8、本发明的目的之二在于提供一种前述酿酒酵母基因工程菌的制备方法。

9、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

10、前述酿酒酵母基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)将所述wwrrugt33糖苷化酶突变体基因和所述蔗糖合酶gmsus的基因构建到表达载体上，得到p426-tef-wwrrugt33-gmsus质粒；

12、(2)将步骤(1)制得的p426-tef-wwrrugt33-gmsus质粒转化进酿酒酵母细胞，得到酿酒酵母基因工程菌sc-rpg。

13、进一步，所述表达载体为p426-tef载体

14、进一步，步骤(1)具体包括如下步骤：

15、1)将rrugt33糖苷化酶(genbank:aui41147.1)的核苷酸序列人工全合成构建到pet-28a(+)载体的限制性内切酶位点hindiii和sali之间，得到pet-28a(+)-rrugt33质粒。

16、2)构建wwrrugt33糖苷化酶突变体：以pet-28a(+)-rrugt33质粒为模板，采用全质粒pcr进行突变；引物为：序列如seq id no.5所示的r14g-f1，序列如seq id no.6所示的r14g-r1，序列如seq id no.7所示的e470w-f1，序列如seq id no.8所示的e470w-r1。

17、3)将rrugt33酶第14位的精氨酸突变为甘氨酸。

18、4)pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后，加入限制性内切酶dpni在37℃消化3h，随后将消化产物转入大肠杆菌dh5α并涂布在含有卡那霉素抗性的lb平板中，然后置于37℃恒温培养过夜。随后挑单菌落置于含有卡那霉素抗性的lb摇瓶中37℃摇床200rpm培养过夜，然后提取质粒即获得pet-28a(+)-rrugt33-r14g。

19、5)将rrugt33酶第470位的谷氨酸突变为色氨酸；后续实验条件同步骤4)，最终得到质粒pet-28a(+)-rrugt33-r14g-e470w。

20、6)采用pcr的方式得到wwrrugt33的基因线性化片段和p426-tef载体线性化片段，引物为：序列如seq id no.9所示的p426-tef-f1，序列如seq id no.10所示的p426-tef-r1，序列如seq id no.11所示的wwrrugt33-f1，序列如seq id no.12所示的wwrrugt33-r1。

21、7)将步骤6)的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析后纯化回收，采用无缝克隆试剂盒进行连接，得到p426-tef-wwrrugt33质粒，随后通过热激法转化进大肠杆菌dh5α中进行培养，随后提取得到p426-tef-wwrrugt33质粒。

22、8)将来源于大豆的蔗糖合酶gmsus(genbank:aac39323.1)的基因经过密码子优化后通过人工合成并构建到p426-tef-wwrrugt33质粒上，得到p426-tef-wwrrugt33-gmsus质粒。

23、进一步，步骤3)中，pcr反应体系为：pet-28a(+)-rrugt33 2μl、primesstar maxpremix(2×)25μl、r14g-f1(10μm)2μl、r14g-r1(10μm)2μl、ddh2o补足至50μl。

24、进一步，步骤3)和5)中，pcr反应条件为：预变性98℃5min；变性98℃10s，退火55℃6s，延伸72℃30s，20个循环；终延伸72℃2min。

25、进一步，步骤5)中，pcr反应体系为：pet-28a(+)-rrugt33-r14g 2μl、primesstarmax premix(2×)25μl、e470w-f1(10μm)2μl、e470w-r1(10μm)2μl、ddh2o补足至50μl。

26、进一步，步骤6)中，wwrrugt33的基因线性化片段的pcr反应体系为：pet-28a(+)-rrugt33-r14g-e470w 2μl，primesstar max premix(2×)25μl，wwrrugt33-f1(10μm)2μl，wwrrugt33-r1(10μm)2μl，ddh2o补足至50μl；wwrrugt33的基因线性化片段的pcr反应条件为：预变性98℃5min；变性98℃10s，退火55℃6s，延伸72℃10s，30个循环；终延伸72℃2min。

27、进一步，步骤6)中，p426-tef载体线性化片段的pcr反应体系为：p426-tef 2μl，primesstar max premix(2×)25μl，p426-tef-f1(10μm)2μl，p426-tef-r1(10μm)2μl，ddh2o补足至50μl；p426-tef载体线性化片段的pcr反应条件为：预变性98℃5min；变性98℃10s，退火55℃15s，延伸72℃30s，30个循环；终延伸72℃5min。

28、本发明的目的之三在于提供一种前述酿酒酵母基因工程菌在生物合成红景天苷中的应用。

29、本发明的目的之四在于提供一种利用前述酿酒酵母基因工程菌发酵生产红景天苷的方法，本发明基于携带wwrrugt33糖苷化酶突变体和蔗糖合酶gmsus的酿酒酵母基因工程菌，以酪醇、葡萄糖、蔗糖为底物合成红景天苷，通过分步添加的方式构建udpg的原位再生体系，解决了udpg供应不足对产量的限制问题，从而实现了红景天苷的高产。

30、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

31、利用前述酿酒酵母基因工程菌发酵生产红景天苷的方法，包括如下步骤：

32、(1)将前述酿酒酵母基因工程菌接种到种子培养基中，培养至od600为4-6，得到种子液；

33、(2)将步骤(1)获得的种子液接种到发酵培养基中，加入葡萄糖进行培养；培养至发酵液中od600为15-20时，加入酪醇继续培养；当发酵液中的酪醇的浓度高于2g/l时停止补加酪醇，当发酵液中红景天苷的浓度达到12g/l-15g/l时，停止添加葡萄糖，改为补加蔗糖继续发酵，得到红景天苷。

34、本发明利用携带wwrrugt33糖苷化酶突变体和来源于大豆的蔗糖合酶gmsus的酿酒酵母基因工程菌，以酪醇、葡萄糖、蔗糖为底物合成红景天苷，在发酵前期通过对葡萄糖和酪醇的补加进行红景天苷的生产和积累udp，当红景天苷和udp积累到一定浓度时，停止葡萄糖的添加，改为添加蔗糖，构建udpg的原位再生体系。这时，蔗糖合酶gmsus将蔗糖和udp催化为udpg和果糖，其中udpg继续用于红景天苷的合成，而果糖用于给细胞提供生长代谢所需的能量。本发明解决了udpg供应不足对产量的限制问题，从而继续高效发酵生产红景天苷。

35、进一步，所述种子培养基和发酵培养基均由如下终浓度的组分组成：(nh4)2so45.0g/l-10g/l，kh2po4 12.0g/l-15.0g/l，mgso4·7h2o 0.3g/l-0.8g/l，葡萄糖10g/l-12g/l，谷氨酰胺0.3g/l-0.8g/l，生物素母液稀释一千倍，金属离子母液稀释一千倍；所述生物素母液由如下终浓度的组分组成：d-生物素50mg/l，d-泛酸钙1000mg/l，维生素b11000mg/l，吡哆醇1000mg/l，烟酸1000mg/l，4-氨基苯甲酸200mg/l，间-肌醇25000mg/l；所述金属离子母液由如下终浓度的组分组成：feso4·7h2o 3.0g/l，znso4·7h2o 4.5g/l，cacl2·2h2o4.5g/l，mncl2·4h2o 1.0g/l，cocl2·6h2o 0.3g/l，cuso4·5h2o 0.3g/l，na2moo4·2h2o 0.4g/l，h3bo3 0.1g/l，ki 0.1g/l，edta19g/l。

36、更进一步，以上试剂除了生物素需过滤灭菌、氨水不用灭菌外，其余试剂需要在高压灭菌锅中115℃灭菌25min。

37、进一步，步骤(1)中，培养条件为：25-40℃条件下摇床180-230rpm培养18-25h；更优选为30℃条件下摇床200rpm培养20h。

38、作为优选，步骤(2)中，所述葡萄糖的浓度为500g/l，所述蔗糖的浓度为500g/l，所述酪醇的浓度为50g/l。

39、进一步，步骤(2)中，种子液的接种量为5％。

40、进一步，步骤(2)中，通过检测发酵液的葡萄糖浓度与尾气分析仪中的rq(呼吸熵)的值来控制葡萄糖的补加速率。

41、进一步，步骤(2)中，控制发酵液中葡萄糖的浓度为0.3g/l或rq的值在0.9-1.1。

42、进一步，步骤(2)中，补加蔗糖时，控制rq的值为0.9-1.1。

43、进一步，步骤(2)中，酪醇的添加速率为0.35-0.5g/l/h。

44、进一步，步骤(2)中，发酵培养温度为28-35℃，ph为5.5-6；初始发酵转速为180-220rpm；发酵初始do(溶解氧)为100％；接种完成后，调整转速为150-200rpm，进气量为1.5-2l/min。

45、作为优选，步骤(2)中，发酵培养条件包括：温度为30℃，ph为5.7；初始发酵转速为200rpm。

46、进一步，ph调节剂为氨水。

47、更进一步，整个发酵过程通过自动控制氨水的补加速率来维持ph在5.7。

48、进一步，利用所述方法小规模发酵生产红景天苷时，发酵期间控制do在35％以上，接种完成后调整转速为200rpm，进气量为2l/min；酪醇的添加速率为0.5g/l/h，控制发酵液中的酪醇浓度不高于2g/l；

49、利用所述方法大规模工业化发酵生产红景天苷时，发酵期间控制do在15％以上，接种完成后调整转速为150rpm，进气量为1.5l/min，酪醇的添加速率为0.35g/l/h；控制原则为发酵液中的酪醇浓度不高于1.2g/l。

50、进一步，所述小规模发酵优选采用50l发酵罐进行发酵培养；所述大规模工业化发酵优选采用500l发酵罐进行发酵培养。

51、进一步，发酵过程中通过手动控制进气量和搅拌转速来控制do。

52、进一步，步骤(2)中，添加酪醇后，每3个小时取一次样，通过hplc检测发酵液中红景天苷和酪醇的浓度。

53、进一步，步骤(2)中，补加蔗糖后，每3个小时取一次样，用hplc检测酪醇和红景天苷的浓度，当红景天苷的浓度在6个小时内无增加时，发酵结束。

54、本发明的有益效果在于：

55、1.利用本发明提供的酿酒酵母基因工程菌sc-rpg来发酵生产红景天苷，在50l发酵罐中发酵135h时红景天苷的产量是45.9g/l，总产量1.93kg，平均产率0.34g/l/h，酪醇的最大转化率95.6％，平均转化率90％。在500l发酵罐中发酵138h时红景天苷的产量是43.2g/l，总产量18.11kg，平均产率为0.312g/l/h，酪醇的最大转化率92.7％，平均转化率86％，相当于2亩红景天种植3年的产量。本发明所提供的生产方法可以从酪醇一步转化得到红景天苷，不仅具有成本低、耗能少、高产率和高转化率的优点，还可以用于大规模的工业化生产，具有显著的经济效益和社会价值。

56、2.本发明对将rrugt33糖苷化酶第14位的精氨酸突变为甘氨酸，以及第470位的谷氨酸突变为色氨酸，得到wwrrugt33糖苷化酶突变体，经过突变让酪醇的转化率提高到90％以上。

57、3.本发明首次在酿酒酵母中通过引入来自大豆的蔗糖合酶gmsus基因构建udpg原位再生体系，为红景天苷的合成提供充足的udpg供应。

58、4.本发明首次在酿酒酵母中利用葡萄糖和蔗糖的分步添加来高效生产红景天苷，前期酿酒酵母以葡萄糖为碳源进行自身生长代谢以及红景天苷的生产，在生产红景天苷的过程中会生成较多的udp，后期停止葡萄糖的添加，改为以蔗糖为碳源为酿酒酵母提供udpg和果糖，其中udpg用于红景天苷的生产，果糖为酿酒酵母提供能量。本发明为红景天苷的发酵生产提供了一种新思路。