一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法。

背景技术：

1、色氨酸侧链氧化酶(tryptophan side-chain oxdase，tso)是从假单胞菌(atcc29574)中发现的能降解色氨酸的羟化酶，在体外能将色氨酸侧链氧化为β-酮基色氨酸。研究表明色氨酸侧链氧化酶作用于色氨酸吲哚环3号位的α碳，不同ph的反应条件生成的产物也不相同，可以生成3-吲哚乙二醇醛、n-乙酰-α,β-脱氢色氨酰胺等。此外，研究发现肿瘤组织对色氨酸的代谢活跃，肿瘤微环境中的色氨酸含量较低，低浓度的色氨酸对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，因此色氨酸侧链氧化酶的制备具有重要意义。

2、目前，色氨酸侧链氧化酶序列信息未知，无法通过基因工程改造的表达菌株，只能从假单胞菌裂解上清获取，由于细菌裂解的上清蛋白较杂，为后续的纯化带来很大困难。专利号为cn116286690a的发明专利提供了1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(cmc)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)催化酰胺化反应制备色氨酸侧链氧化酶吸附剂的方法，该方法中3-吲哚丙烯酸的偶联率仅为20％，对色氨酸侧链氧化酶的吸附效率较低，影响了后续蛋白纯化。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种偶联率高的假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法。

2、本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

3、s1，假单胞菌atcc 29574经裂解，超声破碎和离心后得到粗酶液；

4、s2，将色氨酸溶于n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺和三乙胺搅拌反应，得到淡黄色油状的反应产物；

5、s3，将氨基琼脂糖用n,n-二甲基甲酰胺进行平衡，然后将步骤s2的反应产物加入平衡好的氨基琼脂糖中，震荡反应得到色氨酸偶联的氨基琼脂糖；

6、s4，粗酶液通过色氨酸偶联的氨基琼脂糖作为填料的亲和层析柱进行亲和层析，得到纯化的色氨酸侧链氧化酶。

7、具体的，色氨酸溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，加入脱水剂dcc后发生亲核攻击，生成o-酰基异脲；加入三乙胺作为碱性催化剂，三乙胺中氮原子通过氢键与底物中的氧、氮等原子相互作用，提高了反应物的亲核性，进而提高色氨酸的偶联量。

8、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s2中，所述色氨酸：二环己基碳二亚胺：三乙胺的质量比为(1-2)：(6-7)：(0.1-0.5)，搅拌反应1.5-2h。

9、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3中，氨基琼脂糖：n,n-二甲基甲酰胺的体积比为(1-3)：10，所述反应产物：平衡好的氨基琼脂糖的体积比为2：(1-2)。

10、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s2中，色氨酸溶于n,n-二甲基甲酰胺后，加入二环己基碳二亚胺、三乙胺和4-二甲氨基吡啶进行反应，得到淡黄色油状的反应产物。

11、具体的，中间产物o-酰基异脲不稳定，自身易反应生成稳定产物n-酰基脲，加入亲核性的催化剂dmap作为酰基转化剂，形成稳定的中间酯，提高色氨酸偶联量。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，所述色氨酸：二环己基碳二亚胺：三乙胺：4-二甲氨基吡啶的质量比为(1-2)：(6-7)：(0.1-0.5)：(1.5-2)。

13、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s4亲和层析之前将粗酶液热处理后离心，收集上清液，然后采用上清液进行亲和层析。

14、具体的，本申请发现色氨酸侧链氧化酶具有热稳定性，因此利用该特点采用热水处理变性沉淀的方式来去除上清中杂蛋白，该方法能去除60％-70％的杂蛋白，且色氨酸侧链氧化酶依然能在1h内降解70％的色氨酸，为后续色氨酸侧链氧化酶的提取降低了难度。

15、在以上技术方案的基础上，优选的，热处理方法为：将粗酶液置于水浴锅中热处理，热处理的温度为60-70℃，时间为10-20min。

16、在以上技术方案的基础上，优选的，所述制备方法还包括：经过亲和层析的样品经超滤管浓缩，收集酶液；然后酶液使用分子筛进行凝胶过滤层析，纯化得到色氨酸侧链氧化酶。

17、具体的，分子筛是根据分子量不同的蛋白在凝胶颗粒中的运动方式的不同来纯化分离一定分子量范围的蛋白分子，将亲和层析后的样品经过分子筛进一步纯化，分离得到不同组分的蛋白，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和酶活测试即可鉴定出色氨酸侧链氧化酶。

18、目前仅靠单一层析方法纯化的色氨酸侧链氧化酶纯度有限，对后续结果分析造成很大的干扰。本发明通过亲和层析结合凝胶过滤层析的方式能显著提高色氨酸侧链氧化酶的纯度，大幅度降低后续结果分析的难度。

19、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1中，将活化的假单胞菌atcc 29574接种到lb液体培养基中，待其生长至对数生长期后期收集菌体；在菌体中加入裂解液重悬菌体，然后加入溶菌酶和苯甲基磺酰氟超声破碎菌体，超声结束后离心收集上清得到粗酶液。

20、具体的，与常用的2％bbl培养基相比，lb液体培养基能保证酶液中蛋白含量和酶活不变。此外，lb液体培养基用作细菌发酵液，能大幅度缩减生产成本和简化生产操作，也可以排除bbl不溶的颗粒性物质的干扰。

21、具体的，假单胞菌生长至稳定期时，申请人发现由于次级代谢物的积累，超声过程中上清呈胶状，超声破碎不彻底且无法判断超声效果；若在对数生长前期收菌，菌体量太少，需耗费大量的生产原产料。因此，在对数生长后期收菌是最合适的阶段。

22、在以上技术方案的基础上，优选的，所述裂解液组分为40-60mmol/l柠檬酸盐、80-120mmol/l氯化钠，ph＝5-6，溶剂为纯化水。

23、本发明的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法相对于现有技术具有以下有益效果：

24、(1)本发明加入脱水剂二环己基碳二亚胺后发生亲核攻击，生成o-酰基异脲；加入三乙胺碱性催化剂，三乙胺中氮原子通过氢键与底物中的氧、氮等原子相互作用，提高反应物的亲核性，进而提高色氨酸的偶联量。

25、(2)由于中间产物o-酰基异脲不稳定，自身易反应生成稳定产物n-酰基脲，加入亲核性的催化剂4-二甲氨基吡啶作为酰基转化剂，4-二甲氨基吡啶能有效抑制副产物的生成，形成稳定的中间酯，提高了色氨酸偶联量。

26、(3)目前仅靠单一层析方法纯化的色氨酸侧链氧化酶纯度有限，对后续结果分析造成很大的干扰。本发明通过亲和层析结合凝胶过滤层析的方式能显著提高色氨酸侧链氧化酶的纯度，大幅度降低的后续结果分析的难度。

27、(4)本发明采用热处理的方式除去上清中的杂蛋白，即可以保证色氨酸侧链氧化酶的酶活不受影响，又可以除去60％-70％杂蛋白，为后续色氨酸侧链氧化酶的提取降低了难度。

技术特征：

1.一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤s2中，所述色氨酸：二环己基碳二亚胺：三乙胺的质量比为(1-2)：(6-7)：(0.1-0.5)，搅拌反应1.5-2h。

3.如权利要求1所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤s3中，氨基琼脂糖：n,n-二甲基甲酰胺的体积比为(1-3)：10，所述反应产物：平衡好的氨基琼脂糖的体积比为2：(1-2)。

4.如权利要求1所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤s2中，色氨酸溶于n,n-二甲基甲酰胺后，加入二环己基碳二亚胺、三乙胺和4-二甲氨基吡啶进行反应，得到淡黄色油状的反应产物。

5.如权利要求4所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：所述色氨酸：二环己基碳二亚胺：三乙胺：4-二甲氨基吡啶的质量比为(1-2)：(6-7)：(0.1-0.5)：(1.5-2)。

6.如权利要求4所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤s4亲和层析之前将粗酶液热处理后离心，收集上清液，然后采用上清液进行亲和层析。

7.如权利要求6所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：热处理方法为：将粗酶液置于水浴锅中热处理，热处理的温度为60-70℃，时间为10-20min。

8.如权利要求6所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括：经过亲和层析的样品经超滤管浓缩，收集酶液；然后酶液使用分子筛进行凝胶过滤层析，纯化得到色氨酸侧链氧化酶。

9.如权利要求1所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：步骤s1中，将活化的假单胞菌atcc 29574接种到lb液体培养基中，待其生长至对数生长期后期收集菌体；在菌体中加入裂解液重悬菌体，然后加入溶菌酶和苯甲基磺酰氟超声破碎菌体，超声结束后离心收集上清得到粗酶液。

10.如权利要求9所述的一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，其特征在于：所述裂解液组分为40-60mmol/l柠檬酸盐、80-120mmol/l氯化钠，ph＝5-6，溶剂为纯化水。

技术总结本发明提出了一种假单胞菌中色氨酸侧链氧化酶的制备方法，包括如下步骤：S1，假单胞菌ATCC 29574经裂解，超声破碎和离心后得到粗酶液；S2，将色氨酸溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，然后加入二环己基碳二亚胺和三乙胺反应，得到淡黄色油状的反应产物；S3，将氨基琼脂糖用N,N‑二甲基甲酰胺进行平衡，然后将步骤S2的反应产物加入平衡好的氨基琼脂糖中，震荡反应得到色氨酸偶联的氨基琼脂糖；S4，粗酶液通过色氨酸偶联的氨基琼脂糖作为填料的亲和层析柱进行亲和层析，得到纯化的色氨酸侧链氧化酶。本发明加入脱水剂二环己基碳二亚胺后发生亲核攻击，生成O‑酰基异脲；加入三乙胺碱性催化剂，三乙胺中氮原子通过氢键与底物中的氧、氮等原子相互作用，提高反应物的亲核性，进而提高色氨酸的偶联量。技术研发人员：蔡晓宾,陶新园,高双双,张淑平,王业富受保护的技术使用者：湖北万德瑞生命科学技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18