一种敲除HDAC1基因的细胞系、构建方法及应用

本发明属于基因及细胞生物工程，具体涉及一种敲除hdac1基因的细胞系、构建方法及应用。

背景技术：

1、乙酰化修饰是一种广泛存在的蛋白翻译后修饰形式，是由组蛋白乙酰转移酶(histone ac etyltransferase，hat)与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，hdac)两种相互拮抗酶的动态可逆性调控。目前的研究表明，hdacs在宿主针对病毒性病原的先天免疫应答中扮演着至关重要的角色。根据结构特征将现发现的18个hdacs分为四类，其中ⅰ(hdac1～3和hdac8)、ⅱ(hdac4～7，hdac9和hdac10)、ⅳ(hdac11)型hdacs均为zn2+依赖型酶；ⅲ型(sirt1～7)hdac是nad+依赖型酶。

2、作为i型hdac家族中的重要成员，hdac1主要定位在细胞核中且在不同组织中呈组成性表达。除了参与肿瘤发生外，hdac1也参与先天免疫应答信号通路的调控，hdac1与nf-κb通路p50蛋白c端核定位信号相互作用诱导趋化因子基因所在的染色质重塑；通过与stat1、stat2相互作用调控ifn-α与ifn-γ刺激引起的组蛋白h4去乙酰化与干扰素应答基因的转录，进而参与抗病毒先天免疫。在肺上皮细胞中，hdac1通过与stat1相互作用促进stat1的磷酸化并激活ifitm3、isg15等干扰素刺激基因的表达，从而抑制甲型流感病毒的感染。hdac1还可抑制逆转录病毒——原型泡沫病毒基因的转录和表达。虽然hdac1与病毒之间的相互作用已被证实，但对于hdac1与rna病毒感染中的功能研究相对较少，尤其是动物病毒。

3、小反刍兽疫病毒(pprv)是一种有囊膜的单股负链rna病毒，其感染山羊、绵羊等小反刍动物引起的小反刍兽疫(ppr)是oie法定必须报告的动物疫病。目前，关于hdacs在pprv感染中的功能还不清楚。

4、本研究团队在前期工作中发现，pprv可刺激宿主hdac1 rna转录水平，且对hdac 1具有强抑制作用的mgcd0103可明显抑制pprv病毒的复制。因此，本发明利用2对特异性靶向hdac1基因的sgrna，结合crispr-cas9技术实现了hdac1基因的敲除，获得的单克隆细胞系vero-ko-hdac1，该细胞系能显著抑制pprv的复制。这为研究pprv复制机理提供了一种可用的细胞系，也为研发抗病毒靶点药物提供了新思路。

技术实现思路

1、针对上述情况，本发明提供了2对特异性靶向hdac1基因的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向hdac1基因，结合crispr-cas9技术对vero细胞系进行基因编辑，成功敲除了hdac1基因，获得的单克隆细胞vero-ko-hdac1能够显著抑制pprv复制，提供了抑制pprv复制的新靶点，可作为研究pprv复制机制的细胞系。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种敲除hdac1基因的细胞系，所述的细胞系分类命名为绿猴肾细胞vero-ko-hdac1，于2024年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no：c202416，保藏地址：中国武汉武汉大学，电话：(027)68752319。

3、第二方面，提供了所述的细胞系在抑制小反刍兽疫病毒增殖中的应用。

4、第三方面，提供了所述的细胞系在筛选抑制小反刍兽疫病毒增殖药物中的应用。

5、第四方面，提供了抑制或者沉默细胞中hdac1基因表达的试剂在制备抑制小反刍兽疫病毒增殖细胞系中的应用。

6、优选的，所述试剂包括靶向敲除hdac1基因的sgrna。

7、优选的，所述sgrna包括hadc1-sgrna1和/或hdac1-sgrna2，核苷酸序列为：

8、hdac1-sgrna1-f：5’-caccgagtagtaacagactttcctc-3’；

9、hdac1-sgrna1-r：5’-aaacgaggaaagtctgttactactc-3’；

10、hdac1-sgrna2-f：5’-caccgtggcgcagacgcagggcacc-3’；

11、hdac1-sgrna2-r：5’-aaacggtgccctgcgtctgcgccac-3’。

12、第五方面，本发明提供了一种敲除hdac1基因的细胞系的构建方法，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中hdac1基因编码蛋白功能丧失。

13、优选的，所述方法包括以下步骤：

14、(1)制备特异性靶向hdac1基因的sgrna，在sgrna片段正向序列的5’端加入cac c粘性末端，在反向序列的5’端加入aaac粘性末端，作为靶向hdac1基因的sgrna寡聚核苷酸；

15、(2)将步骤(1)制备的sgrna插入到lenticrispr v2表达质粒载体的多克隆位点，得到同时表达cas9蛋白基因和打靶sgrna序列的重组载体；

16、(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，用嘌呤霉素抗生素筛选杀死阴性细胞，通过亚克隆的方法获得单个细胞株，获得敲除hdac1基因的细胞系。

17、优选的，步骤(1)所述sgrna包括hadc1-sgrna1和/或hdac1-sgrna2，核苷酸序列为：

18、hdac1-sgrna1-f：5’-caccgagtagtaacagactttcctc-3’；

19、hdac1-sgrna1-r：5’-aaacgaggaaagtctgttactactc-3’；

20、hdac1-sgrna2-f：5’-caccgtggcgcagacgcagggcacc-3’；

21、hdac1-sgrna2-r：5’-aaacggtgccctgcgtctgcgccac-3’。

22、本发明的有益效果是：①本发明提供了一种靶向hdac1基因的sgrna，所述sgrna能够特异性靶向hdac1基因，结合crispr-cas9技术可实现宿主细胞中hdac1基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；②本发明提供了一种通过crispr-cas9技术将所述sgrna转染于宿主细胞，构建hdac1基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法；③依据本发明所述方法获得了单克隆细胞系vero-ko-hdac1；于2024年1月24日送往中国典型培养物保藏中也进行保藏，分类命名为非洲绿猴肾细胞vero-ko-hdac1，保藏编号：cctcc no：c202416，地址：中国武汉，武汉大学。形态与vero细胞相似，呈近圆形，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰；适合在含10％胎牛血清的dmem/f12培养基中生长，细胞倍增时间为48h；细胞传至30代以上仍可稳定沉默hdac1基因，并不表达hdac1蛋白。④依据本发明所述方法获得的单克隆细胞系vero-ko-hdac1能够显著抑制pprv的复制，可作为研发预防和治疗pprv药物的新靶点，并作为研究pprv复制机制的细胞系。