一种集成式多重微生物检测纸芯片

本发明涉及一种集成式多重微生物检测纸芯片，属于微生物检测。

背景技术：

1、由环境中的致病微生物引起的传染病是威胁公共健康的主要原因，病原微生物导致了流行病的大规模爆发和重大的经济损失。然而，在一个样本中可能同时存在多种病原微生物，明确致病菌的种类是传染性疾病早诊断、及时采取有效治疗措施、减少病死率的重要环节。然而，对一个样本中的多个目标同时检测可能需要耗时的过程和额外的仪器。在这种情况下，对目标的多重细菌检测不仅可以即时提供数据，以降低潜在的致病风险，还可以减少检测成本和时间。

2、传统的病原菌检测方法主要基于细菌培养、免疫反应和分子诊断等。尽管传统的检测方法在病原菌的检测和预防方面做出了重大贡献，但仍有许多需要解决的不足。为了克服现有传统检测方法的缺点，实现更快、更方便的检测，即时检验（poct）的概念被提出，poct主要包括基于免疫反应和基于分子诊断的方法。基于分子诊断的方法因为具有很高的灵敏度和准确性而备受关注。然而，传统的分子诊断通常涉及三个关键步骤，即核酸提取、扩增和检测，目前这三个步骤由劳动密集、高成本和耗时的过程组成，极大地限制了其在即时诊断中的应用。因此，在单个设备上开发集核酸提取、扩增和检测于一体的分子诊断方法在病原微生物的早期诊断和评估中具有很大的前景，已经成为检测领域的热点。

3、目前，已经有多项研究开发出基于集成芯片的“样本进-结果出”的设备，这些设备结合了芯片上的核酸提取、扩增和快速检测。然而，这些设备在流体处理中通常需要一些外部电源来完成整个检测过程，例如高压电源，驱动泵（如压力泵、注射泵和流动泵），以及用于离心的机械旋转器。此外，大多数基于集成芯片的器件通常由pdms和pmma制成，这需要复杂的制造工艺，例如使用光刻技术、湿式化学蚀刻或高精度的激光切割技术，降低了它们在poct领域的适用性。

4、2007年whitesides团队首次提出μpads（微流控纸芯片）的概念，微流控纸芯片由膜和/或纸组成，可以使用简单和低成本的亲水疏水图案化、纸张堆叠或折叠技术制造，更具成本效益和环境友好性。并且纸基装置依靠纸张纤维本身的毛细作用驱动，因此液体在芯片中的流动不需要复杂的外部驱动源。此外，纸张允许试剂预先干燥存储在集成设备中，这减轻了冷链运输和存储的需要，并且预制试剂可以省去多次加样的操作，使整个检测过程易于操作。基于纸张的集成核酸扩增检测正在迅速发展，特别是侧流层析技术，已成为当前的研究热点，这使得实现简单且具有成本效益的核酸检测成为可能。

5、然而，基于纸芯片的微生物检测方法存在三个重要的技术问题需要解决：

6、（1）相比于实验室常用的实时荧光定量pcr等核酸检测技术，基于纸芯片的核酸检测技术受限于有限的反应空间，在灵敏度和特异性等方面还存在一定差距。

7、（2）目前最常见的纸基微流控产品是侧向层析试纸，但是该类产品的缺陷在于无法控制液体在纸张中的流动，当反应需要一定的孵育时间时，操作人员需要先在试管中配置试剂并进行一段时间的反应后再插入试纸条读出结果，核酸提取和扩增步骤总是与最后在试纸条上读出结果的步骤分开进行，这需要多个步骤处理，增加了试剂损失和交叉污染的风险，限制了其应用场景和范围。

8、（3）利用纸张进行核酸提取、反应不同于利用自动化仪器或在液相体系中进行，涉及多个处理步骤，加之用于核酸分析的菌液、血液样本等可能存在黏滞度大、成分复杂等问题，要在纸基材料上完成核酸的提取的同时保证后续反应和检测效率是制约纸芯片发展的关键因素。此外，纸基材料本身不具有反应能力，需要对其处理、修饰使它具备运输、存储、反应和检测等功能。目前通过改良纸基本身以契合核酸扩增效率的研究仍较少。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种集成式多重微生物检测纸芯片，结合环介导等温扩增技术和crispr技术的信号放大方法，将样品处理、核酸扩增和核酸检测整合到一个纸芯片上，构建一种“样本进-结果出”的检测方法，以实现对致病菌的简单、快速、自动化和多重诊断。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

3、一种集成式多重微生物检测纸芯片，包括背板和固定在背板上且沿水平方向依次设置的缓冲纸垫、样品纸垫、反应纸垫和吸水纸垫；缓冲纸垫的后端与样品纸垫的前端贴合，样品纸垫上预埋有核酸释放剂；反应纸垫的底部为纸基底垫，纸基底垫上并列设有两个以上亲水区，每个亲水区上自下而上依次设有壳聚糖纸垫、tris-hcl纸垫、lamp反应纸垫和crispr反应纸垫，每个亲水区上lamp反应纸垫和crispr反应纸垫分别针对不同微生物的核酸进行扩增放大和释放荧光信号；每个亲水区的前端分别通过连接纸垫与样品纸垫的后端连接；每个亲水区的前端分别通过连接纸垫与吸水纸垫连接；

4、使用时，将待测微生物菌液样品滴加至样品纸垫上，经核酸释放剂裂解释放核酸；向缓冲纸垫滴加无核酶水，裂解释放的核酸在无核酶水的扩散作用下经连接纸垫转移至反应纸垫，并依次经壳聚糖纸垫吸附、tris-hcl纸垫洗脱后在lamp反应纸垫扩增放大得到含有待测靶标的扩增子，所述扩增子在crispr反应纸垫上进行荧光探针切割反应，外部荧光成像设备对crispr反应纸垫上荧光信号进行检测实现多种微生物的定性和定量检测；吸水纸垫用于吸收多余无核酶水。

5、进一步的，所述纸芯片还包括用于封装的外壳，外壳顶部在缓冲垫、样品垫和反应垫的对应区域分别开有加水孔、加样孔和反应观察孔。

6、进一步的，所述亲水区、壳聚糖纸垫、tris-hcl纸垫、lamp反应纸垫和crispr反应纸垫均为尺寸相同的圆形结构。

7、进一步的，所述缓冲纸垫、样品纸垫和吸水纸垫的长度相同，均为20~30mm；所述缓冲纸垫、样品纸垫和吸水纸垫的宽度分别为3~8mm、15~20mm和3~8mm；所述亲水区的直径为5~10mm；亲水区与样品纸垫之间的连接纸垫长度为25~40mm，亲水区与吸水纸垫之间的连接纸垫长度为1~5mm，所述缓冲纸垫、样品纸垫、反应纸垫和吸水纸垫沿宽度方向依次设置。

8、进一步的，所述待测微生物样品和无核酶水的加样量分别为100~120μl和200~220μl。

9、进一步的，所述壳聚糖纸垫是滤纸经充分浸渍浓度为0.5%w/v~2%w/v的壳聚糖溶液后、干燥得到的。

10、进一步的，所述tris-hcl纸垫是滤纸经充分浸渍浓度为10mm~50mm、ph为9~9.5的tris-hcl溶液后、干燥得到的。

11、进一步的，所述lamp反应纸垫通过以下方法制备得到：将bst dna、dntp、mgso4、内外引物和无核酶水混合配制lamp反应体系，将lamp反应体系冻干在滤纸上；bst dna的浓度为0.128u~0.448u，dntp的浓度为1.4mm~2.2 mm，mgso4的浓度为6 mm~2.2mm，内外引物的浓度（内引物：外引物）为1:6~1:12。

12、进一步的，在所述述lamp反应纸垫进行反应时，反应温度为50℃~58℃，孵育时间为40~60 min。

13、进一步的，所述crispr反应纸垫通过以下方法制备得到：将荧光探针、crrna、cas12a酶、核糖核酸酶抑制剂和无核酶水混合配制crispr反应体系，将crispr反应体系冻干在滤纸上；荧光探针的浓度为0.75μm~3.75μm，crrna的浓度为0.25μm ~0.05μm，cas12a酶的浓度为0.025μm ~0.125μm，核糖核酸酶抑制剂的浓度为0.5~8u。

14、进一步的，在所述crispr反应纸垫上反应时，反应温度为37℃~52℃，孵育时间为5~30min。

15、有益效果

16、本发明提供了一种集成式多重微生物检测纸芯片，整个反应过程全部基于纸基材料，通过设计具有不同功能的纸垫，并设置多个反应区，将各个功能区集成，实现了基于全纸的核酸提取、扩增和检测一体化，且各个反应区域相对独立，避免了试剂损耗和交叉污染。

17、本发明提供了一种集成式多重微生物检测纸芯片，用壳聚糖对纸表面进行改性使其具备核酸吸附的能力，将反应体系冻干在纸上以降低其保存和运输需求，并且反应体系的预制可以使整个过程只需要简单的加样即可完成全部反应，避免了复杂的操作过程和试剂的污染；

18、本发明提供了一种集成式多重微生物检测纸芯片，通过对特定靶标的扩增和cas酶的切割作用实现微量核酸信号的放大，并产生大量荧光信号，提高了检测的灵敏度，并且可以将荧光强度与浓度对应起来，实现定量检测，解决了在有限的纸基反应空间上难以实现精确定量的问题。

19、本发明通过将多种微生物的检测反应区进行集成可实现更高通量的检测。本发明具有灵敏度高、高度集成、特异性强、便携、高通量和可扩展性强的特点。具体的：（1）灵敏度高：本发明将等温扩增和信号放大的方法结合，提高了检测灵敏度，检测限可达到1 copy/μl；（2）高度集成：整个检测反应过程实现高度集成化，所需检测和功能试剂全部以冻干和干燥的形式预埋在纸上，因此只需要简单的加样操作即可完成整个检测反应过程，简化了操作人员的操作流程，不需要中间过程的人为干预，对人员操作水平要求低，并且可有效避免实验室中进行常规生物反应操作所伴随的样本及设备间的交叉污染风险或者人为操作不当带来的结果误差以及lamp反应导致的气溶胶污染。特别是当待检样品中含有细菌、病毒、支原体、衣原体等传染性病原体时，可有效降低检测过程的生物安全风险；（3）特异性强：本检测方法通过cas12a与crrna所形成的复合物对扩增后的靶序列进行检测，能特异性的识别并结合目标序列，有效的避免了假阳性现象；（4）便携：纸芯片可以与其配套的检测仪相结合，使整个设备小型化，便于携带，更加适合现场快速检测；（5）高通量：通过多个试纸条并行处理以及不同区域的分级反应可实现对待测样本多种致病菌核酸的高通量快速检测，改善了目前基于纸的检测设备无法在有限的纸基反应空间上实现高通量检测的问题，对基于分子诊断的发展和细菌感染性疾病的快速检测和疾病源头的阻断具有重大意义；（6）可扩展性强：本发明能通过改变引物序列和crrna序列或更换样品实现对不同生物样品的检测，可扩展性强。