一种靶向GPC3的鲨鱼单域抗体VNAR-F10及其应用

本发明属于抗体制备，特别涉及一种靶向gpc3的鲨鱼单域抗体vnar-f10及其应用。

背景技术：

1、单克隆抗体是迄今为止生物制药高速发展的关键驱动因素。然而，传统单克隆抗体的体积大，在组织中的穿透性和积累量有限，并且它在制造、运输和储存过程中存在溶解性和稳定性不足等问题，容易导致抗体的聚集和蛋白质变性，限制了抗体药物的进一步发展。随着抗体工程技术的发展，为了弥补传统单抗的局限性，抗体的尺寸变得越来越小，它们具有较低的分子量，仅由重链或轻链的简单结构组成。1993年研究者首次在骆驼科动物的血液中发现一种天然缺失轻链只含重链的抗体（heavy chain antibodies, hcabs），它的可变区（variable heavy chain domain ,vhh）与传统igg抗体抗原结合区具有相似的结合活性，同时因其分子量约为15 kda，也称为纳米抗体（nanobody）。两年后，andrew等研究者在护士鲨（ ginglymostoma cirratum）中发现了另一种仅有重链的ig亚型（new antigenreceptor，ignar），随后也在其他软骨鱼的体内发现了ignar。软骨鱼类ignar中仅包含抗体可变区的抗体片段称为单域抗体（single-domain variable new antigen receptor,vnar），其分子量约为12kda，是自然界中发现的最小的抗原结合域，具有分子量小、结构简单、稳定性强、组织渗透性好等特点，它们能克服传统抗体的不足，并有望治疗更多的疾病，成为治疗性抗体的良好来源。

2、肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率均居高不下，中国肝癌病例数位居全球第一，肝癌负担沉重。早期肝癌诊断率不足15%，绝大多数患者被发现时已到中晚期，而晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低。肝癌现有治疗手段都不足以成为治愈肝癌的有效方式，因此寻找肝癌诊断、治疗的有效靶点，降低肝癌死亡率具有十分重要的意义。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3, gpc3）是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员之一，它通过糖基磷脂酰肌醇锚结合于细胞表面。gpc3核心蛋白由580个氨基酸组成，大小为70 kda。gpc3能通过刺激wnt/β-catenin信号传导促进肝癌细胞生长，同时gpc3已被证明能与生长因子相互作用，作为辅助受体并通过其硫酸乙酰肝素链调节生长因子活性，并最终刺激细胞生长。gpc3在肝癌组织中高表达，在成人正常器官和肝炎等良性肝病的肝细胞中不表达，且gpc3的高表达与肝癌的预后差呈正相关。总之，gpc3是肝癌诊断与治疗的优良靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种靶向gpc3的鲨鱼单域抗体vnar-f10及其应用，本发明通过筛选得到了全新的鲨鱼单域抗体vnar-f10，其对gpc3具有高亲和力和高特异性。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种靶向gpc3的鲨鱼单域抗体vnar-f10，其氨基酸序列如seq idno.9所示。

4、进一步的，所述鲨鱼单域抗体vnar-f10包含固定氨基酸序列fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4、高变区域hv2和hv4、互补决定区cdr1和cdr3。

5、进一步的，所述cdr3的氨基酸序列为kayigrytpgcpyrwify。

6、本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

7、进一步的，克隆所述编码基因的正向引物的序列如seq id no.11所示，反向引物的序列如seq id no.12所示。

8、本发明还提供了包含所述的编码基因的重组质粒。

9、本发明还提供了包含所述的编码基因的重组菌株。

10、本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体在制备gpc3蛋白靶向剂中的应用。

11、本发明还提供了所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10或所述的编码基因在制备肿瘤检测试剂和治疗肿瘤的药物中的应用。

12、进一步的，所述肿瘤为肝癌。

13、本发明所述单域抗体，具有如下优势：

14、1、本发明制备得到的鲨鱼单域抗体vnar-f10分子量小，只有18 kda左右，比传统的单克隆抗体更小；

15、2、所述鲨鱼单域抗体vnar-f10稳定性高、组织渗透性好，比常规抗体更容易储藏与运输，且与gpc3具有良好的亲和力和特异性；

16、3、更易表达和基因工程改造，vnar-f10利用大肠杆菌原核表达系统进行表达，并最终得到大量鲨鱼单域抗体；

17、所述鲨鱼单域抗体vnar-f10序列组成为fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4、hv2、hv4、cdr1和cdr3，其中fr1和fr4为固定氨基酸序列，hv2和hv4为高变区域，其影响抗原的结合位点，cdr1和cdr3为抗体的互补决定区，其决定于不同抗原结合。在此情况下，其具有识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3, gpc3）的能力。同时，由于其特殊的可变结构域，vnar是分子量最小的抗体结构。因此，vnar克服了传统抗体在应用方面的缺点和不足。此外本发明选择条纹斑竹鲨(chiloscyllium plagiosum)作为抗体制备的模式动物来进行vnar的制备，其不属于濒危鲨鱼种类，且体型小、易于人工繁养，适合用于抗体开发。

18、所述鲨鱼抗体vnar-f10可应用于诊断和治疗肝癌的药物，编码vnar-f10的基因或重组质粒或含有该基因的重组质粒的重组细胞可应用于制备免疫检测诊断试剂盒、流式细胞检测、细胞免疫荧光检测以及肝癌的治疗与诊断。

技术特征：

1.一种靶向gpc3的鲨鱼单域抗体vnar-f10，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.9所示。

2.根据权利要求1所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10，其特征在于，所述鲨鱼单域抗体vnar-f10包含固定氨基酸序列fr1、fr2、fr3a、fr3b和fr4、高变区域hv2和hv4、互补决定区cdr1和cdr3。

3.根据权利要求2所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10，其特征在于，所述cdr3的氨基酸序列为kayigrytpgcpyrwify。

4.权利要求1所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

5.根据权利要求4所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10的编码基因，其特征在于，克隆所述编码基因的正向引物的序列如seq id no.11所示，反向引物的序列如seq id no.12所示。

6.含有权利要求4所述的编码基因的重组载体。

7.含有权利要求4所述的编码基因的工程菌株。

8.权利要求1所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10在制备gpc3蛋白靶向剂中的应用。

9.权利要求1所述的鲨鱼单域抗体vnar-f10或权利要求5所述的编码基因在制备肿瘤检测试剂和治疗肿瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

技术总结本发明公开了一种靶向GPC3的鲨鱼单域抗体VNAR‑F10及其应用。所述鲨鱼单域抗体VNAR‑F10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。本发明制备得到的鲨鱼单域抗体VNAR‑F10分子量小，只有18 kDa左右，比传统的单克隆抗体更小；所述鲨鱼单域抗体VNAR‑F10稳定性高、组织渗透性好，比常规抗体更容易储藏与运输，且与GPC3具有良好的亲和力和特异性；VNAR‑F10利用大肠杆菌原核表达系统进行表达，更易表达和基因工程改造，并最终得到大量鲨鱼单域抗体。所述鲨鱼单域抗体VNAR‑F10可应用于诊断和治疗肝癌的药物，编码VNAR‑F10的基因或重组质粒或含有该基因的重组质粒的重组细胞可应用于制备免疫检测诊断试剂盒、流式细胞检测、细胞免疫荧光检测以及肝癌的治疗与诊断。技术研发人员：顾玉超,冯世涛,任雯,王小月受保护的技术使用者：中国海洋大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18