PD-L1靶向融合蛋白及其使用方法与流程

本发明总体上涉及融合蛋白，并且更具体地涉及靶向pd-l1的三特异性杀伤接合器(engager)分子和其用于治疗癌症的用途。

背景技术：

1、免疫疗法是一种激活或抑制免疫系统以放大或减小免疫应答的个体化治疗，并且在治疗各种形式的癌症方面发展迅速。癌症的免疫疗法(如嵌合抗原受体(car)-t细胞、car-自然杀伤(nk)细胞、pd-1和pd-l1抑制剂)旨在帮助患者的免疫系统对抗癌症。t细胞的激活取决于t细胞受体(tcr)与肽结合的主要组织相容性复合物(mhc)的特异性组合，以及t细胞的共刺激分子与抗原呈递细胞(apc)上配体的相互作用两者。

2、免疫检查点(如pd-1、pd-l1、pd-l2和ctla4)是保持许多受体-配体相互作用以避开免疫系统并促进增殖的分子。开发了若干种阻断这些蛋白质的单克隆抗体(mab)，以下调抑制性免疫应答并促进消除肿瘤细胞的t细胞的细胞毒性。在免疫检查点阻断药物中，靶向pd-1或ctla4的抑制剂成功用于治疗患有转移性黑色素瘤的患者，具有改进的应答和延长的生存期。这一成功使得此类用于治疗广泛范围的恶性肿瘤的药剂得到开发，所述恶性肿瘤包含肾细胞癌(rcc)、nsclc和急性髓系白血病(aml)，与常规治疗相比，所述药剂进一步提高了应答率并延长了患者的生存时间(yang等人,《国际生物科学杂志(int j biolsci)》2020；16(11):1767-1773)。

3、程序化细胞死亡-1受体(pd-1)和其配体(pd-l1/pd-l2)属于免疫检查点蛋白家族，其作为共抑制因子可以阻止或限制t细胞应答的发展。pd-1在经激活的t细胞的表面上表达，而pd-l1和pd-l2在树突细胞或巨噬细胞的表面上表达。pd-1/pd-l1相互作用确保免疫系统仅在适当时间被激活，以使慢性自身免疫炎症的可能性最小化。在正常条件下，免疫系统执行一系列步骤，所述一系列步骤基于由呈递肿瘤抗原的树突细胞激活t细胞以及由t细胞释放诱导靶癌细胞的细胞凋亡的细胞毒素来引起抗癌免疫应答和癌细胞死亡。

4、pd-1/pd-l1通路表示响应于内源性免疫抗肿瘤活性而由肿瘤细胞所发挥的适应性免疫抵抗机制。pd-l1在肿瘤细胞上或肿瘤微环境中的未转化细胞上过表达。在肿瘤细胞上表达的pd-l1与经激活的t细胞上的pd-1受体结合，这导致细胞毒性t细胞的抑制。这些失活的t细胞在肿瘤微环境中仍受到抑制。

5、尽管取得了一定成功，但仍有一些限制因素降低了mab疗法的总体效率。随着cd16定向的双特异性和三特异性单链片段可变(bike和trike)重组分子的开发，避免了这些不期望的限制因素中的大多数限制因素，同时引起高效应子功能，因为所述重组分子缺乏整个抗体的fc部分，并且对cd16具有靶向特异性(gleason等人,《分子癌症疗法(mol cancerther)》；11(12)；2674–84,2012)。因此，重组试剂对于在临床上用于增强自然杀伤(nk)细胞免疫疗法具有吸引力。

6、nk细胞识别和杀死靶标的能力受到抑制性和激活性细胞表面受体的复杂组库的调节。nk细胞细胞毒性可以通过经由天然细胞毒性受体(ncr)介导的天然细胞毒性而发生，或者由如利妥昔单抗(rituximab)等抗体通过cd16(即由nk细胞的cd56dim子集高度表达的免疫球蛋白g(igg)的激活性低亲和力fc-γ受体)触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)而发生。cd16/cd19 bike和cd16/cd19/cd22 trike可以通过cd16的直接信号传导触发nk细胞激活，并且诱导裂解颗粒的定向分泌和靶细胞死亡。此外，这些试剂诱导nk细胞激活，使得产生细胞因子和趋化因子。

技术实现思路

1、本发明是基于pd-l1靶向融合蛋白、以及具体地靶向pd-l1的三特异性杀伤接合器分子(trike)的开发。

2、在一个实施例中，本发明提供了一种如seq id no:13或14中所示的分离的核酸序列或与其具有90％同一性的序列。

3、在另一个实施例中，本发明提供了一种由如seq id no:13或14中所示的核酸序列或与其具有90％同一性的序列编码的蛋白质。

4、在一个方面，氨基酸序列选自seq id no:6或7。

5、在另外的实施例中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含在任一取向上彼此可操作地连接的seq id no:6和7中所示的氨基酸序列。

6、在一个方面，所述蛋白质包含在seq id no:6的c末端与seq id no:7的n末端之间直接连接的seq id no:6和7。在另一方面，所述蛋白质包含在seq id no:7的c末端与seqid no:6的n末端之间直接连接的seq id no:7和6。

7、在另外的实施例中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含seq id no:1或15中所示的序列和与seq id no:1或15具有90％或更高同一性的序列。

8、在一个实施例中，本发明提供了一种融合蛋白，其包含可操作地连接的seq idno:2或23；4、21或22；6和7或7和6。

9、在一个方面，seq id no:2或23和4、21或22通过seq id no:3或seq id no:16连接。在另一方面，seq id no:4、17或18和6或7通过seq id no:5或seq id no:17连接。在其它方面，seq id no:6和7在任一取向上可操作地连接。在一些方面，所述融合蛋白进一步包含半衰期延长(hle)分子。在一个方面，所述hle分子为包含seq id no:25-29中的任一个的fc或scfc抗体片段。在一些方面，seq id no:4具有n72取代。在各个方面，n72突变为n72a或n72d。在一个方面，所述蛋白质如seq id no:21或22中所示。

10、在一个实施例中，本发明提供了一种融合蛋白，其在任一取向上包含seq id no:23、seq id no:21或22以及seq id no:6和7。在一个方面，seq id no:23通过seq id no:3或16的接头可操作地连接到seq id no:21或22。在另一方面，seq id no:21或22在任一取向上通过seq id no:5或17的接头可操作地连接到seq 6和7。在一些方面，所述融合蛋白进一步包含半衰期延长(hle)分子。在一个方面，所述hle分子为包含seq id no:25-29中的任一个的fc或scfc抗体片段。

11、在另外的实施例中，本发明提供了一种编码本文所述的融合蛋白中的任一种的分离的核酸序列。

12、在一个方面，所述序列为seq id no:8或18。

13、在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含向所述受试者施用本文所述的融合蛋白中的任一种，由此治疗所述癌症。

14、在一个方面，所述癌症选自非小细胞肺癌、皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、原发性肝细胞癌、结直肠癌、透明细胞肾癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、脑癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、头颈癌或乳腺癌。在一些方面，进一步向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。在各个方面，所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：程序化细胞死亡1蛋白(pd-1)抑制剂、pd-1配体1(pd-l1)抑制剂、pdd-l2抑制剂、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)抑制剂、腺苷a2a受体(a2ar)抑制剂、b7-h3抑制剂、b7-h4抑制剂、b和t淋巴细胞衰减子(btla)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)抑制剂、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)抑制剂、淋巴细胞激活基因-3(lag3)抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nadph氧化酶同种型2(nox2)抑制剂、唾液酸结合性免疫球蛋白型凝集素7(siglec7)抑制剂、siglec9抑制剂、t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(tim-3)抑制剂以及t细胞激活的v结构域ig抑制因子(vista)抑制剂。