一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途与流程

本发明涉及色谱填料领域，特别是涉及一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。

背景技术：

1、蛋白质在材料表面的吸附一直以来都是科学界关注的问题，因为它与许多重要的科学和工业生产密切相关。蛋白吸附在蛋白质的纯化分离，药物传递以及食品加工过程都有着很重要的作用。现有的蛋白不吸附材料主要是以peg为代表。peg是一种中性的亲水高分子，由重复的氧乙烯基(-ch2ch2o-)组成，由于分子本身独特的结构,能够与水形成氢键，赋予peg链高度的亲水性和良好的水溶性。围绕peg链的氢键可以结合大量的水分子，同时分子链本身的高度流动以及具有很大的空间排斥力，防止了蛋白质分子的吸附，从而避免了进一步的生化反应。然而peg目前也存在一定的问题，比如peg的蛋白不吸附性对分子排列有一定要求，过于紧密或分子量太大都会失去效果。另外，peg双端羟基结构的特殊性致使其在合成过程中不具有选择性通常无法保留端羟基，从而限制了其应用。目前市面上色谱填料对蛋白质有较强的非特异性吸附问题和批次间重现性不好的问题。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。本技术中所述色谱填料解决了现有技术中peg的蛋白不吸附性对分子排列要求高，在合成过程中不具有选择性，对蛋白质有较强的非特异性吸附和批次间重现性不好的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。

3、本发明第一方面公开了一种体积排阻色谱填料的制备方法，包括如下步骤：硅烷偶联剂与聚合物进行第三化学反应获得硅烷；所述聚合物的结构式为，所述聚合物平均分子量为150~1100；所述硅烷偶联剂的末端具有氰酸酯官能团；所述硅烷与羟基化硅胶进行第四化学反应获得所述体积排阻色谱填料。所述平均分子量为所述聚合物中所有分子的分子量之和与分子个数的比值。

4、所述聚合物上氨基与羟基不同的反应性保证了后续合成过程中不同的选择性，带来了良好的分离选择性。

5、优选地，所述羟基化硅胶表面的硅羟基浓度为2.5~3.0μmol/m2，如所述羟基化硅胶表面的硅羟基浓度可以为2.5μmol/m2、2.6μmol/m2、2.7μmol/m2、2.8μmol/m2、2.9μmol/m2、3.0μmol/m2。

6、优选地，所述羟基化硅胶粒径为3~6μm，如所述羟基化硅胶粒径可以为3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm。

7、优选地，所述羟基化硅胶比表面积为100~150m2/g，如所述所述羟基化硅胶比表面积可以为100m2/g、110m2/g、120m2/g、130m2/g、140m2/g、150m2/g。

8、优选地，所述羟基化硅胶平均孔径为20~40nm，如所述羟基化硅胶平均孔径可以为20nm、25nm、30nm、35nm、40nm。

9、优选地，所述聚合物的制备方法包括：

10、a1)聚乙二醇与甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷在催化剂的催化下进行第一化学反应获得tso-peg-oh，所述第一化学反应的反应路线为：

11、；

12、a2)所述tso-peg-oh与氯化铵溶于氨水进行第二化学反应，所述第二化学反应的反应路线为：

13、。

14、更优选地，所述步骤a1）中聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比1：（0.9~1.1）如所述步骤a1）中聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。

15、更优选地，所述催化剂为氧化银和/或碘化钾，进一步优选地，加入催化量的所述催化剂。

16、更优选地，所述聚乙二醇的羟值为100~600mgkoh/g，如所述聚乙二醇的羟值可以为100mgkoh/g、150mgkoh/g、200mgkoh/g、250mgkoh/g、300mgkoh/g、350mgkoh/g、400mgkoh/g、450mgkoh/g、500mgkoh/g、550mgkoh/g、600mgkoh/g。

17、所述聚乙二醇的不同羟值对应不同的聚合度，作为原料可以给所述色谱填料带来针对不同蛋白质的分离选择性。

18、更优选地，所述第一化学反应的时间为1~4h，如所述第一化学反应的时间可以为1h、2h、3h、4h。

19、更优选地，所述步骤2）中所述tso-peg-oh与氯化铵的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述tso-peg-oh与氯化铵的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。

20、更优选地，所述氨水的浓度为20~35wt%，如所述氨水的浓度可以为20wt%、23wt%、26wt%、29wt%、32wt%、35wt%。

21、更优选地，所述第二化学反应后进行分离提纯。

22、优选地，所述硅烷偶联剂为异氰酸丙基三甲氧基硅烷。

23、优选地，所述硅烷偶联剂与所述聚合物的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述硅烷偶联剂与所述聚合物的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。

24、优选地，所述第三化学反应在无水条件下进行。

25、优选地，所述第三化学反应在保护范围下进行。

26、优选地，所述第三化学反应的温度为70~80℃，如所述第三化学反应的温度可以为70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。

27、优选地，所述第三化学反应的时间为12~48h，如所述第三化学反应的时间可以为12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h。

28、优选地，所述第四化学反应中还采用有反应介质，所述反应介质为乙醇。

29、优选地，所述第四化学反应在保护氛围下进行。

30、优选地，所述羟基化硅胶与硅烷的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述羟基化硅胶与硅烷的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。

31、优选地，所述第四化学反应的温度为70~80℃，如所述第四化学反应的温度可以为70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。

32、优选地，所述第四化学反应的时间为20~72h，如所述第四化学反应的时间可以为20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、60h、64h、68h、72h。进一步优选地，所述第四化学反应的时间为24~48h。

33、更优选地，所述第四化学反应后进行后处理，所述后处理包括分离出所述色谱填料。

34、进一步优选地，所述后处理还包括对所述分离出的色谱填料进行洗涤和/或干燥的步骤，洗涤用溶液为thf。

35、更优选地，所述第三化学反应和第四化学反应四中的保护氛围为惰性气体填充无氧氛围。在一个具体实施例中，所述惰性气体为氮气。

36、本发明第二方面公开了如上文所述的制备方法获得的体积排阻色谱填料。

37、本发明第三方面还公开了如上文所述色谱填料在分离蛋白质中的用途。

38、优选地，所述蛋白质选自甲状腺蛋白、γ-球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、核糖核苷酶a、尿嘧啶、聚合血红蛋白、人促红素、人粒细胞刺激因子、iii型胶原蛋白、溶菌酶、人血白蛋白中的一种或多种。

39、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

40、1.本发明通过单端键合氨基，保留端羟基，氨基与羟基不同的反应性保证了后续合成过程中不同的选择性，从而达到保留端羟基的目的，保留peg链端基的亲水能力，带来了良好的分离选择性。

41、2.本发明通过对聚乙二醇进行单边修饰，然后选用异氰酸丙基三甲氧基硅烷作为偶联剂制备硅烷，所述硅烷与羟基化硅胶桥连，从而在羟基化硅胶表面键合一层均匀纳米厚度的中性亲水层。独有的表面修饰技术，保证硅胶表面键合完全且均匀，确保了所述填料具有良好的稳定性和批次之间的较好重现性。

42、3.利用聚乙二醇链上的氧原子易于水分子形成氢键，再通过与水结合在其表面构筑水合层或者利用空间排斥的作用防止蛋白质、多肽等生物大分子在表面上的吸附。

43、4.本研究利用异氰酸酯引入适量的疏水基团，用简单可控的方法带来良好的分离选择性。

44、5.本研究可以通过调节聚乙二醇聚合度带来不同的分离选择性。