用于非平胸目鸟类性别鉴定的RAA引物组和探针及应用的制作方法

本发明涉及生物，特别是涉及用于非平胸目鸟类性别鉴定的raa引物组和探针及应用。

背景技术：

1、性别鉴定对野生动物种群的性别比例估计、种群动态保护以及进化和生态学研究具有重要意义。然而，世界上大约有50％的鸟类是单态的，即不能从外观形态上判断出鸟类的性别，这在雏鸟中尤为明显。即使是二态鸟，在雏鸟时期也很难通过外观形态来区分性别。目前，分子学方法已经发展并应用于许多鸟类的性别鉴定，主要是通过对性连锁色域解旋酶dna结合蛋白1(chd1)w和z等位基因之间的序列差异进行扩增和凝胶电泳分析。然而，w和z染色体上的chd1基因序列在多种鸟类中并不高度保守。

2、在各种分子学性别鉴定方法中，pcr扩增结合凝胶电泳是应用最广泛的方法之一。实时聚合酶链反应结合熔融曲线分析最近越来越多地用于性别测定。虽然高分辨率熔融分析已被证明比pcr更灵敏，但需要昂贵的设备且耗时，不适合在该领域广泛应用。最近，恒温扩增技术被用于鸟类的性别鉴定。环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification；lamp)技术已被开发用于鸟类的性别鉴定，但需要4个或更多的引物。重组酶聚合酶等温扩增法(recombinase polymerase amplification；rpa)或重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification；raa)是一种快速、特异、高效的等温扩增技术，在39℃条件下可在10-30min内检测到特异的核酸片段。rpa/raa采用重组酶、单链dna结合蛋白(single-stranded binding protein；ssb)和dna聚合酶来代替热循环扩增过程，与pcr相比更为快速便捷。目前，该方法已广泛应用于临床病原菌的检测和性别鉴定。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种用于鉴定非平胸目鸟类性别的引物组和探针，利用该引物组和探针能够在20分钟内完成若干种非平胸目鸟类的性别鉴定。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鉴定非平胸目鸟类性别的引物组和探针，该引物组包括：

3、上游引物：5’-ttatggtcctatgcctaccacattcctatt-3’(seq id no：11)；

4、下游引物：5’-tgttgttggcactgatttagttccttgctt-3’(seq id no：12)；

5、该探针的序列如下所示：acattagggtcactgaattttacttaaaagtttcagtgcatttatttt(seq id no：13)。

6、前期研究中，在w染色体上发现了一个独特的保守序列0.6kb ecori片段(ee0.6)，该序列是一个非重复序列，包含一个外显子序列且ee0.6虽然具有高度保守性，然而并非针对该片段的所有引物都能实现较好的性别鉴定效果，在不同种类的鸟中还是存在差异的，甚至部分鸟类的ee0.6序列并不明确，因此，想要一次性针对若干种非平胸目鸟类完成性别鉴定，具有相当的难度。本发明人经过反复实验，发现上述引物组能够在30分钟内完成若干种非平胸目鸟类的性别鉴定，且仅需1对引物、1个探针，鉴定结果具有较高的灵敏性，对雌性鸟类特异性较好。

7、在其中一个实施例中，所述探针第31位碱基t替换为荧光基团fam，第32位碱基t替换为四氢呋喃，第33位碱基t替换为淬灭基团bhq1，所述探针的3’端修饰c3spacer。

8、本发明还提供了所述的raa引物组和探针在制备用于鉴定非平胸目鸟类性别的试剂和/或试剂盒中的应用。

9、本发明还提供了一种用于鉴定非平胸目鸟类性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述raa引物组及探针。

10、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括raa酶。

11、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：raa酶5-7mg，buffer a 25-30μl，10μm的上游引物和下游引物各2-4μl，10μm的探针0.6-0.8μl，待检dna模板5-7μl，buffer b 2.5-3.5μl，ddh2o 12.6-14μl。

12、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：raa冻干酶粉5mg，buffer a 25μl，10μm的上游引物和下游引物各2μl，10μm的探针0.6μl，待检dna模板5μl，280mm的buffer b2.5μl，ddh2o 13.1μl。

13、在其中一个实施例中，所述引物组的工作浓度为0.35-0.45μm，所述探针的工作浓度为0.08-0.15μm。

14、所述工作浓度为上述引物组在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述引物组的产品时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。

15、本发明还提供了一种非平胸目鸟类性别鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测样本的dna，采用所述试剂盒进行raa反应。

16、鉴于鸟类性别鉴定的困难，研究者们开始通过分子性别鉴定的方法来解决这一问题。但传统的聚合酶链反应(polymerase chain reaction；pcr)方法耗时长且依赖实验室设备。故，本发明人提出采用重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification；raa)技术，该技术是一种简便、快速、灵敏度和特异性高的等温扩增方法。本发明人将上述引物组、探针与raa技术相结合，建立了一种基于实时raa(real-time raa)的鸟类快速性别鉴定方法，该方法能在20分钟内完成，并利用了多种鸟类的羽毛样本进行验证，针对雌性具有良好的特异性，检测下限为10pg，灵敏度是传统pcr的10倍。对于临床样本，该方法成功地鉴定了8种鸟类的性别，与传统pcr法100％一致。因此，该方法以及配套的引物组、探针、试剂盒能够，为非平胸目鸟类的性别鉴定提供了一种新的灵敏特异、高效可靠的现场检测工具，这对鸟类性别鉴定的现场检测中具有重要意义，为进一步研究性别比例和圈养管理提供依据。

17、在其中一个实施例中，所述raa反应的反应条件包括：在38-41℃进行恒温扩增20-30min。

18、在其中一个实施例中，所述raa反应通过恒温荧光检测仪实现。

19、在其中一个实施例中，所述待测样本包括羽毛。

20、在其中一个实施例中，所述非平胸目鸟类包括家鸡、环颈雉鸡、红腹锦鸡、镰翅鸡、红腹角雉、鹧鸪、火鸡、白冠长尾雉中的至少1种。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、本发明的用于鉴定非平胸目鸟类性别的引物组、探针、试剂盒及其应用，利用该引物组能够在20分钟内完成若干种非平胸目鸟类的性别鉴定。将该引物组与实时raa法结合构建得到的非平胸目鸟类性别鉴定方法，能够利用多种鸟类的羽毛样本进行验证，针对雌性具有良好的特异性，检测下限为10pg，灵敏度是传统pcr的10倍。对于临床样本，成功鉴定了8种鸟类的性别，与传统pcr法100％一致。因此，该方法以及配套的引物组、探针、试剂盒能够成为一种强大的现场检测工具，为非平胸目鸟类的性别鉴定提供了一种新的灵敏特异、高效可靠的现场检测工具，这对鸟类性别鉴定的现场检测中具有重要意义，为进一步研究性别比例和圈养管理提供依据。