用于检测幽门螺杆菌耐药基因位点的引物组和试剂盒的制作方法

本发明涉及生物，特别是涉及用于检测幽门螺杆菌耐药基因位点的引物组和试剂盒。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种螺旋形、微需氧的弯曲状革兰阴性细菌，该菌可高度适应胃黏膜，感染后难以自发清除。研究表明，hp定植与慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃肠道病变的发生有关。1994年，国际癌症研究机构把hp定为i类致癌因子。根除hp可以有效缓解胃粘膜炎性反应，特别是活动性胃粘膜炎症，治愈溃疡并预防消化性溃疡病的复发；根除hp也可以缓解胃malt淋巴瘤；早期根除hp可以在一定程度上降低胃癌发生的风险。

2、该菌感染了世界50％至70％的人口，有些发展中国家感染率甚至高达80％以上，是全球最普遍的病原体之一，可导致胃肠道疾病。我国hp感染率高，平均发生率农村人口为66％，城市人口为47％。成人感染hp后，不会自行消除，抗生素治疗是目前消除hp感染的常见策略。

3、hp感染的根除治疗一直以来都是以经验性治疗模式为主。目前，幽门螺杆菌的根除方案主要包括质子泵抑制剂(ppi)、胃粘膜保护剂和一种或两种抗生素，构成三联或四联疗法。质子泵抑制剂(ppi)是继h2受体阻断药后的一类重要的抑制胃酸分泌药，也是目前抑制胃酸分泌作用最强的一类药物。用于根除幽门螺杆菌的抗生素包括克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类药物(左氧氟沙星)、阿莫西林、四环素、利福平等。目前，质子泵抑制剂(ppi)、阿莫西林、克拉霉素或甲硝唑的三联疗法是根除hp感染的首选方案，该方案已经在国际会议上得到共识。

4、1990年代初，根除幽门螺杆菌的比率超过80％。但是近年来，随着全球幽门螺杆菌菌株对最常用抗生素的细菌耐药性不断增加，在过去20年中，许多国家的抗生素耐药性已超过15～20％的门槛，克拉霉素、阿莫西林和甲硝唑的耐药性水平最高分别达50％、30％和95％。多药耐药性的出现显著影响幽门螺杆菌根除标准疗法的疗效，导致幽门螺杆菌的根除率在全球范围内不断下降。为了最好地优化幽门螺杆菌感染的管理，幽门螺杆菌的治疗应基于局部和个体抗菌素耐药性模式，针对具体患者量身定制有效的抗生素治疗策略可能会大大减少治疗失败并降低抗生素耐药性。

5、传统检测幽门螺杆菌耐药性的方法是将细菌做分离培养，培养成功后再做耐药测试，进而判断患者耐药情况，但是幽门螺杆菌培养要求高、成功率低、时间长，大大限制了该方法在临床上的应用。随着对幽门螺杆菌耐药分子机制的深入研究，国内外研究者尝试开发分子生物学方法对耐药基因进行检测，通过对应的耐药位点基因分型确定患者感染的幽门螺杆菌的耐药情况，主要检测方法包括pcr-荧光探针法、二代测序法等。但是pcr-荧光探针法包含基因单一，检测位点少，一次检测不能全面覆盖临床常用药物对应的耐药位点；二代测序技术虽然能得到多位点的突变信息，但价格昂贵、用时长。

6、因此，急需要开发一种操作简单、快速、通量高、低成本、特异性强的方法来检测幽门螺杆菌耐药位点，为临床诊断幽门螺杆菌及用药提供指导。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供用于检测幽门螺杆菌耐药基因位点的引物组和试剂盒，以期解决现有技术中存在的问题。

2、为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

3、本发明的第一方面保护用于检测幽门螺杆菌耐药基因位点的引物组，所述的引物组包括扩增引物组和延伸引物组，所述的扩增引物组包含序列如seq id no.1所示至seqid no.42所示的扩增引物。

4、在本技术的某些实施方式中，所述的扩增引物组中的引物可以是每条扩增引物的单独形式存在，也可以是扩增引物的混合物。优选地，所述的扩增引物组是扩增引物的混合物。

5、在本技术的某些实施方式中，所述的扩增引物组分为第一扩增引物组和第二扩增引物组，所述的第一扩增引物组包含序列如seq id no.1所示至seq id no.20所示的扩增引物，所述的第二扩增引物组包含序列如seq id no.21所示至seq id no.42所示的扩增引物。

6、在本技术的某些实施方式中，所述的延伸引物组中的引物可以是每条延伸引物的单独形式存在，也可以是延伸引物的混合物。优选地，所述的延伸引物组是延伸引物的混合物。

7、在本技术的某些实施方式中，所述的延伸引物组包含序列如seq id no.43所示至seq id no.69所示的延伸引物。

8、在本技术的某些实施方式中，所述的延伸引物组分为第一延伸引物组和第二延伸引物组，所述的第一延伸引物组包含序列如seq id no.43所示至seq id no.52所示的延伸引物，所述的第二延伸引物组包含序列如seq id no.53所示至seq id no.69所示的延伸引物。

9、在本技术的某些实施方式中，所述的幽门螺杆菌耐药基因包括6种抗生素耐药基因。

10、优选地，所述的6种抗生素包括克拉霉素、喹诺酮类药物、甲硝唑、阿莫西林、四环素和呋喃唑酮。

11、更优选地，所述喹诺酮类药物选自氧氟沙星、诺氟沙星、二氟沙星、氟罗沙星、奥比沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、司帕沙星和洛美沙星中的一种或多种。

12、更优选地，克拉霉素耐药基因包括23srrna，位点包括a2142g、a2143g和a2115c。

13、更优选地，喹诺酮类药物耐药基因包括gyra，位点包括87-snp1和87-snp2。

14、更优选地，阿莫西林耐药基因包括pbp1，位点包括t1096c、g1120c_t、c1267t、c1667g、a1684t、a1777g、g1783a和c959t。

15、更优选地，呋喃唑酮耐药基因包括pord和oord，位点包括c347g、c156t、c165t、a335g和c349a_g。

16、更优选地，四环素耐药基因包括16srrna，位点包括16s_926、16s_927和16s_928。

17、更优选地，甲硝唑耐药基因包括rdxa，位点包括a91g、c92a、t262c和g392a。

18、优选地，检测对象还包括1种质子泵抑制剂代谢基因，所述质子泵抑制剂代谢基因包括cyp2c19，位点包括rs4986893和rs4244285。

19、本发明的第二方面保护上文所述的引物组在制备检测幽门螺杆菌耐药基因位点的产品中的用途。

20、在本技术的某些实施方式中，所述的产品包括试剂盒、膜条、芯片、检测试剂或检测系统。

21、本发明的第三方面保护一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因位点的试剂盒，包括如上文所述的引物组。所述的试剂盒能检测幽门螺杆菌6种抗生素耐药基因和1种质子泵抑制剂代谢基因，共计27个检测位点。

22、在本技术的某些实施方式中，在由所述的扩增引物组形成的混合物中，每条扩增引物的浓度为0.5～1μm。优选地，浓度可以为0.5～0.8μm，也可以为0.6～0.9μm，也可以为0.7～1μm。在某个优选的实施方式中，为0.8μm。

23、在本技术的某些实施方式中，每条扩增引物可按等摩尔比混合。

24、在本技术的某些实施方式中，在由所述的延伸引物组形成的混合物中，每条延伸引物的浓度为5～15μm。优选地，可以为5～10μm，也可以为8～12μm，也可以为10～15μm。在某个优选的实施方式中，为10μm。

25、在本技术的某些实施方式中，每条延伸引物可按等摩尔比混合。

26、在本技术的某些实施方式中，所述的试剂盒还包括1)pcr扩增反应用试剂、2)虾碱性磷酸酶消化反应用试剂或3)延伸反应用试剂。

27、优选地，1)中，所述的pcr扩增反应用试剂包括pcr缓冲液、mgcl2、dntps、pcr酶和水性介质。更优选地，所述pcr缓冲液通常可以向扩增反应体系提供最合适的酶催反应的条件。所述pcr缓冲液只要起到上述作用即可。更优选地，所述dntps通常作为dna合成中的原料，具体可以包括datp、dgtp、dttp、dctp等。更优选地，所述水性介质选自ddh2o。在一具体实施方式中，pcr扩增反应用试剂包括10×pcr缓冲液0.5μl、mgcl20.4μl、dntps mix 0.1μl、pcr酶0.2μl、ddh2o1.8μl和扩增引物(pcrprimer mix)1μl。

28、优选地，2)中，所述的虾碱性磷酸酶消化反应用试剂包括sap酶、sap缓冲液和水性介质。更优选地，所述水性介质选自ddh2o。在一具体实施方式中，所述sap消化反应的体系为sap缓冲液0.17μl、sap酶0.3μl、ddh2o1.53μl。

29、优选地，3)中，所述的延伸反应用试剂包括iplex单碱基延伸酶、iplex缓冲液、iplex终止混合液和水性介质。更优选地，所述水性介质选自ddh2o。在一具体实施方式中，所述延伸反应用试剂包括iplex单碱基延伸酶(iplex pro enzyme)0.04μl、iplex缓冲液(iplex buffer plus)0.2μl、iplex终止混合液0.2μl、延伸引物混合物(iplex primermix)0.94μl、ddh2o 0.62μl。

30、优选地，所述试剂盒还包括用于从待测样本中提取基因组dna的试剂。所述从样品中提取基因组dna的试剂可以采用现有的试剂盒。

31、更优选地，所述待测样本来自人。更优选地，待测样本选自胃粘膜组织和粪便中的一种或两种。

32、本发明的第四方面保护上文所述的试剂盒在制备检测幽门螺杆菌耐药基因位点的产品中的用途。

33、本发明的第五方面保护一种幽门螺杆菌耐药基因位点的检测方法，包括如下步骤：

34、1)扩增引物和待测样本的dna进行pcr扩增反应，得到扩增产物；

35、2)对所述的扩增产物进行消化处理，得到消化产物；

36、3)延伸引物和所述的消化产物进行延伸反应，得到延伸产物；

37、4)将所述的延伸产物纯化，进行质谱检测；

38、所述的扩增引物包含序列如seq id no.1所示至seq id no.42所示的扩增引物，和/或所述的延伸引物包含序列如seq id no.43所示至seq id no.69所示的延伸引物。

39、本发明的检测方法能同时检测幽门螺杆菌6种抗生素耐药基因和1种质子泵抑制剂代谢基因，共计27个检测位点。

40、在本技术的某些实施方式中，所述的扩增引物分为第一扩增引物组和第二扩增引物组，所述的第一扩增引物组包含序列如seq id no.1所示至seq id no.20所示的引物，所述的第二扩增引物组包含序列如seq id no.21所示至seq id no.42所示的引物。

41、在本技术的某些实施方式中，所述的延伸引物组分为第一延伸引物组和第二延伸引物组，所述的第一延伸引物组包含序列如seq id no.43所示至seq id no.52所示的引物，所述的第二延伸引物组包含序列如seq id no.53所示至seq id no.69所示的引物。

42、在本技术的某些实施方式中，1)中，pcr扩增反应还包括加入pcr扩增反应用试剂。

43、在本技术的某些实施方式中，1)中，分别于波长为230、260和280nm处检测dna的吸光值并计算得到dna浓度，dna浓度需满足：浓度≥10ng/μl，纯度1.5≤a260/280≤2.2，a260/230≥0.4。

44、在本技术的某些实施方式中，1)中，所述的pcr扩增反应的条件为：95℃2分钟；95℃30秒、56℃30秒、72℃60秒，45个循环；72℃5分钟。

45、在本技术的某些实施方式中，2)中，消化处理还包括加入虾碱性磷酸酶消化反应用试剂。

46、在本技术的某些实施方式中，2)中，所述消化反应的条件为：37℃40分钟，85℃5分钟。

47、在本技术的某些实施方式中，3)中，延伸反应还包括加入延伸反应用试剂。

48、在本技术的某些实施方式中，3)中，所述延伸反应的条件优选为：95℃30秒；[95℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环]，40个循环；72℃3分钟。

49、在本技术的某些实施方式中，4)中，所述纯化包括但不限于树脂脱盐纯化。所述树脂脱盐纯化为：所述延伸引物、水和洁净树脂混合，进行脱盐去离子防干扰处理，然后离心。优选地，所述离心的条件优选为3200g离心5分钟。

50、在本技术的某些实施方式中，所述待测样本来自人。优选地，待测样本选自胃粘膜组织和粪便中的一种或两种。

51、在本技术的某些实施方式中，所述质谱检测为通过飞行时间质谱获得耐药基因位点的碱基类型。优选地，根据碱基类型，判断患者是否对幽门螺杆菌具有耐药性。

52、本技术中，所述的方法为非疾病诊断或治疗方法。

53、本发明的检测方法与pcr-荧光探针法技术相比：pcr-荧光探针法包含基因单一，检测位点少，如果需要检测多位点，所需成本较高。本技术的检测方法基于多重pcr-飞行时间质谱技术检测，是利用多重pcr技术，可以在一个反应中检测多个位点，不需要荧光标记，有效降低了成本；所需样本量少(dna上样量在1ng以上都可以准确检出)，对于样本的要求低。

54、本发明的检测方法与抗原检测技术相比：抗原技术虽然方便，但只能得到定性结果(是否感染幽门螺杆菌)，对于用药无指导意义。本技术的检测方法基于多重pcr-飞行时间质谱技术，其不仅能确定患者是否感染幽门螺杆菌，而且也能确定该菌特定位点的基因型，对后续患者用药具有明确的指导意义。

55、本发明的检测方法与二代测序技术相比：二代测序技术虽然能得到多位点的突变信息，但价格昂贵、用时长；同时针对hp耐药检测项目，二代测序通量大大冗余，效费比低。本技术的检测方法基于多重pcr-飞行时间质谱技术，检测通量为10-30个位点，通量适合hp耐药检测项目需求，可以有效降低成本，且检测流程用时较少(整个流程大概8h)。

56、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

57、1)本发明的引物组对多个幽门螺杆菌耐药基因位点的特异性强，引物组的投入量在1ng到1000ng时扩增条带明显，扩增效率高。

58、2)本发明的试剂盒通过2个反应即可对幽门螺杆菌的多个耐药基因及1个人质子泵抑制剂代谢基因的相关位点进行检测，具体为6种抗生素耐药基因和1种质子泵抑制剂代谢基因共27个位点，并且在8个小时之内即可完成一轮检测，操作简单，不会出现假阳性，检测成本低；且对样本要求低，胃粘膜标本和粪便标本都能很好检出，适合辅助诊断。

59、3)本发明的试剂盒通过单碱基延伸，利用不同碱基间分子量的差异来区分检测位点，能直接准确的检测所检测点的碱基类型，特异性强；不使用荧光探针，避免了相似位点的荧光干扰，检测结果精确，2个反应完成实验实现27个位点检测，实验成本低。

60、4)本发明通过对幽门螺杆菌耐药基因位点进行大规模筛选，针对6种抗生素耐药基因和1个质子泵抑制剂代谢基因共筛选出27个位点，其能全面反映幽门螺杆菌耐药性，降低了检测的难度和成本，能有效指导临床用药。