一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体

本发明属于生物，具体涉及一种用于活化co2的甲酸脱氢酶突变体，包含该甲酸脱氢酶突变体氨基酸序列、核苷酸序列及其构建的表达载体和重组工程菌株，以及所述甲酸脱氢酶突变体、表达载体和重组工程菌株在活化co2中的应用。

背景技术：

1、生物催化将co2转化为甲醇具有实现co2活化和经济性转化的潜力，在这一反应过程中，甲酸脱氢酶fdh发挥了核心作用，这一过程的瓶颈问题是生物酶制剂的催化活性和稳定性。在co2转化为甲醇的多酶级联反应中，利用来源于博伊丁假丝酵母的商品甲酸脱氢酶cbfdh催化甲酸→co2的速率(km＝3.3mm，vmax＝0.02mm/min)远高于co2→甲酸的速率(km＝30-50mm，vmax＝0.002mm/min)。因此，co2定向高效转化为甲酸和其他产物存在挑战性。

2、目前，为改善甲酸脱氢酶fdh活性和稳定性，通过蛋白工程改造挖掘高效甲酸脱氢酶已成为提高co2活化效率的重要途径。kim等通过在thiobacillus sp.knk65ma表达甲酸脱氢酶基因，获得比candida boidinii商品甲酸脱氢酶高5.8倍的甲酸产率(plos one,2014,9,e103111)。tishkov等通过比较9个不同来源甲酸脱氢酶氨基酸序列，并结合pseudomonas sp.101生物酶制剂三级结构分析，对pseudomonas sp.101甲酸脱氢酶的5个丝氨酸残基位置131、160、168、184和228进行诱变，获得比野生型甲酸脱氢酶热稳定性提高1.5倍的突变体(febs letters,1999,445,183-188)。专利cn202011179775.1利用短肽识别模型ppr生物信息学平台，首次建立完整的甲酸脱氢酶数据库和短肽序列库(6987条蛋白序列、53个ppr组)，成功预测不同类型的甲酸脱氢酶的功能，自主创制来源于paracoccussp.mku1高效新型甲酸脱氢酶fdhpa，其对co2亲和性和催化活性分别是商品甲酸脱氢酶cbfdh的1.6和22.8倍。

3、通过自主开发或改造甲酸脱氢酶，虽然改善了酶的催化活性和稳定性，提高了co2活化效率，然而因co2活化反应体系的复杂性，现有甲酸脱氢酶和/或其突变体在缓冲液中的结构稳定性和催化活性仍受到限制，甲酸产量远未达到规模化生物制造的需求，因此，进一步提高甲酸脱氢酶活化co2的性能至关重要。基于以上背景和优势，本发明对前期自主创制的高效甲酸脱氢酶进行理性和非理性设计，获得对co2活化还原效率进一步提升的甲酸脱氢酶突变体，为co2经济性转化为甲醇提高技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于活化co2的甲酸脱氢酶突变体，包括甲酸脱氢酶的氨基酸序列、编码其的核苷酸序列、基因表达载体以及重组工程菌株。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于活化co2的甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体具有(i)或(ii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

4、(i)其氨基酸序列由seq id no.1所示序列突变而来，选自如下的一个或多个氨基酸残基发生突变：159位、235位、270位、274位，且氨基酸残基突变后为ile、gly、leu、met；

5、(ii)所述甲酸脱氢酶突变体与(i)所述序列seq id no.1具有≥99％相同性的氨基酸序列；

6、本发明中优选的甲酸脱氢酶突变体，优选地，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的氨基酸突变为以下所示氨基酸残基：在159位为ile，和/或者在235位为gly，和/或者在270为leu，和/或者在274位为met；和/或以上位点的两个或多个氨基酸残基突变。

7、优选地，所述甲酸脱氢酶突变体为一组位点159ile或274met，两组位点159ile和274met，以及三组位点159ile和235gly和274met。

8、优选地，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为seq id no.2、seq idno.3、seqid no.4和seq id no.5。

9、第二方面，一种编码权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸，优选地，如编码seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列；更优选地，如seq id no.6、seq idno.7、seq id no.8和seq id no.9所示的核苷酸序列。

10、第三方面，本发明还提供了一种基因表达载体。所述基因表达载体包括：编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸序列。

11、所述表达载体可以是大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体。优选地，所述基因表达载体为pet质粒，优选为petduet质粒。

12、第四方面，本发明还提供一种如第三方面所述的基因表达载体的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

13、通过基因合成将seq id no.1序列构建于petduet质粒的bamhi/saci酶切位点之间，构建质粒petduet-fdh。基于第一方面所述的单位点设计引物，以petduet-fdh为模板，通过pcr扩增序列，获得到单位点表达载体；多位点表达载体构建方法相同，以单位点表达载体为模板构建依次构建。

14、示例性的，所述构建方法具体包括如下步骤：

15、基于第一方面所述的单位点设计引物，即以第二方面所述如seq id no.6或seqid no.7突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，以petduet-fdh为模板，通过pcr扩增整个质粒序列，获得到单位点表达载体。两个位点表达载体构建：以含有seq id no.6序列的表达载体为模板，以seq id no.7突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，通过pcr扩增构建。三位点表达载体：以含有seq id no.8序列的表达载体为模板，以seq id no.9突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，通过pcr扩增构建。

16、第五方面，一种用于活化co2的重组工程菌，包含如第三方面所述的基因表达载体和/或编码第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸和/或第二方面所述的核苷酸。所述工程菌可以是e.coli bl21(de3)。

17、第六方面，本发明还提供一种利用如第五方面所述的重组工程菌制备甲酸的方法，所述方法包括如下步骤：

18、将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，经超声破碎后进行蛋白纯化，得到游离的甲酸脱氢酶突变体，所述游离酶与含辅酶nadh的缓冲液混合，通入co2反应，经8m尿素终止反应后，检测nadh消耗量和甲酸浓度。

19、作为本发明优选的技术方案，所述反应的温度为25～40℃，例如可以是25℃、30℃、35℃或40℃等，时间为0.5～3h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h或3h等，优选为0.5～1h。

20、优选地，所述混合液中nadh的浓度为0.001～5mm，例如可以是0.001mm、0.002mm、0.005mm、0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm、1mm、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm等，优选为0.5～1mm。

21、优选地，所述混合液中甲酸脱氢酶的浓度为0.20mg/ml；；

22、优选地，所述缓冲液为100mm磷酸缓冲液，ph为7.0；

23、优选地，所述催化反应的温度为25℃；

24、优选地，所述催化反应在静置的条件下进行；

25、优选地，所述诱导后的菌液离心后，还包括在冻存操作，所述冻存为：在-80℃下冻存1h以上。

26、本发明中，在活化co2后，检测nadh消耗的方法为：

27、用100mm ph 7.0的缓冲液中配制浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00mm的nadh标准溶液，通过多功能微孔板检测仪检测其在340nm波长处的od值来制作nadh标准曲线，并依据标准曲线确定反应液中nadh的消耗量。

28、第七方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体、如第二方面所述的核苷酸、如第三方面基因表达载体或如第五方面所述的重组工程菌株在活化co2中的应用。

29、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

30、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

31、(1)本发明提供了一种能够高效活化co2的型甲酸脱氢酶突变体，所述该甲酸脱氢酶突变体同时可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，甲酸脱氢酶突变体游离酶催化活化co2时，催化效率较最高为原始酶的743％；

32、(2)本发明提供的甲酸脱氢酶突变体在150mm h2o2中放置1h后剩余酶活>50％，具有优良的抗氧化性；甲酸脱氢酶突变体氧化方向催化活性均低于原始酶，尤其是突变体seqid no.9，其氧化方向的初始反应速率和活性最低，有利于高效活化co2，有潜在的应用前景。