环状粘着抑制剂的制作方法

专利名称：环状粘着抑制剂的制作方法本申请是1992年7月6日提交的序号为07/909，367申请的部分继续申请。本发明涉及基于式Ⅰ(a)-(r)的环肽(Ⅰ)(a)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala);(b)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);(c)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);(d)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);(e)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);(f)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);(g)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala);(h)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly);(i)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);(j)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);(k)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);(l)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);(m)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val);(n)环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val);(o)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);(p)环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val);(q)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);(r)环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)，及其生理上适合的酸加成盐的新的药物组合物。上面和下面所示的氨基酸残基的缩写代表下列氨基酸Ala丙氨酸Arg精氨酸Asp天冬氨酸Gly甘氨酸His组氨酸Leu亮氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Val缬氨酸此外，下列缩写的含意如下BOC叔丁氧羰基CBZ苄氧羰基DCCI二环已基碳化二亚胺DMF二甲基甲酰胺FAB快原子轰击HOBt1-羟基苯并三唑M+分子离子峰OMe甲氧基式Ⅰ(a)-(r)的化合物及其生理上适合的酸加成盐是已知的。在FEBSLett.291，50-54(1991)中描述了它们，该文献的全部公开内容合并于此供参考。在该文献中，描述了它们的制备以及它们的构象分析。已知专门抑制β3integrin受体配位体相互作用(粘着受体拮抗物，“ARA”)的化合物可被用作治疗骨质疏松、血栓、心肌梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛和肿瘤的药物。此外，所述化合物在破骨细胞形成时抑制细胞粘着，因而适于作为有助于血管形成和伤口愈合的药剂。本发明旨在于找到能阻碍β3integrin血纤维蛋白原结合的ARA，进而为本文所述目的提供更好的药物。因此，本发明的目的是提供可作为药物的新颖的药物组合物。本发明的目的还包括使之产生药物活性的方法。通过本说明书及附后的权利要求，本发明的其它目的和优点对本领域的技术人员来说是显而易见的。非常令人惊奇地发现式Ⅰ(a)-(r)的化合物及其生理上适合的酸加成盐具有所述粘着受体拮抗性能，这些性能在以往未曾被提及。所述效果的发现采用的是述于J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)的J.W.Smith，Z.M.Ruggeri，T.J.Kunicki和D.A.Cheresh等人的方法。所述方法的细节如下于涂覆缓冲液中以100μl/孔用受体(αIIβ3;αvβ3，1μg/ml)涂覆一个96孔未处理的平底平板，4℃在振荡器上培养过夜。平板用结合缓冲液洗涤一次，然后于30℃用阻滞缓冲液(100μl/孔)阻滞2小时。再用结合缓冲液洗涤后，加入生物素化的配位体和竞争物。以1μg/ml的终浓度使用配位体血纤维蛋白原。以递增的浓度加入竞争物。同时加入配位体和竞争物，每孔加50μl，用结合缓冲液稀释成终浓度的两倍。盖上平板并于30℃温育3小时，为除去未结合的物质，用结合缓冲液(100μl/孔)洗涤平板3次。加入于结合缓冲液中的羊抗生物素抗体碱性磷酸酶结合物(1∶2000稀释度)并于30℃温育平板1小时。用结合缓冲液洗涤平板3次，加入底物溶液并在室温下在暗处显色1-5分钟。通过加入0.4MNaOH(100μl/孔)停止反应并在ELISA读数器上于405nm处读数。所有数据都是三次试验的结果。得到的IC50值如下化合物 IC50(μM)αIIbβ3αVβ3环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala)0.320.90环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala)0.761.10环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala)1.500.25环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala)0.760.31环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly)0.130.62环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly)0.060.54环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala)22.004.50环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly)20.501.52环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly)1.530.16环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly)1.501.06环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala)0.620.48环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala)0.740.37环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)>10052.00环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)0.60<0.05环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)>1000.77环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)0.300.05本发明还涉及式Ⅰ的化合物及其生理上可接受的盐对制备药物组合物的应用，特别是用非化学方法制备药物组合物。为此，可将它们与至少一种固体、液体和/或半液体载体或助剂一起转化为适宜的给药形式，还可适当地与一种或多种其它活性化合物结合使用。本发明还涉及含有至少一种式Ⅰ的化合物和/或其生理上可接受的盐之一的药剂，特别是药物组合物。这些组合物可用作人类医药或兽药。适宜的载体为适合于肠道(例如口服)、肠胃外或局部给药且不与这种新化合物反应的有机或无机物质，例如水、植物油、苯甲醇、亚烷基二醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯，明胶、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石和凡士林。特别适用于口服给药的是片剂、丸剂、包衣片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、糖浆、汁液或滴剂，特别适用于直肠给药的是栓剂，特别适用于肠胃外给药的是溶液，较好的是油溶液或水溶液，也可以是悬浮液，乳液或植入物，特别适用于局部给药的是软膏、乳膏或粉剂。也可将新化合物冷冻干燥，可使用得到的冻干物，例如用于制备注射用品。可将所述的组合物灭菌和/或在该组合物中含有助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲物质、着色剂、调味剂和/或芳香物质。若需要，还可含有一种或多种其它活性化合物，例如一种或多种维生素。这些化合物可作为药物活性化合物用于人和作为兽药使用，特别是用于治疗和预防血栓形成、心肌梗塞、心绞痛、中风和肿瘤，即癌症。本发明还涉及式Ⅰ化合物在抵抗疾病方面的应用，特别是它们在人体或动物体中的治疗应用。具体地说，它们是细胞粘着的抑制剂，可用于抑制，例如，血细胞和肿瘤细胞的集聚。因此，这些化合物可用于抑制动物细胞，例如哺乳动物的体细胞或癌细胞的粘着。本发明的物质通常以类似于其它已知市售肽，特别是以类似于美国专利4，472，305所述的化合物的情况给药，优选的给药剂量为大约0.05-500，特别是0.5-100mg/剂量单位。日剂量最好是大约0.01-2mg/kg体重。然而，对于每个接受治疗患者的具体剂量取决于多种不同的因素，例如取决于所用特定化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别，饮食、给药时间和途径、以及排泄速率、药物组合和所治疗的具体病症的严重程度。优选肠胃外给药。不需进一步详尽阐述，相信本领域的技术人员能够根据前面的描述最充分地利用本发明。因此，下列优选的具体实施方案仅仅是说明性的，不以任何方式限制本发明的范围。在上面的描述和下面的实施例中，所有温度均为未修正的摄氏度，除非另外指明，所有份数和百分比均以重量计。以上和以下所引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容均作为本文的参考。制备实施例将2.0gBOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala-OMe溶于60ml甲醇，加入1.5ml2N氢氧化钠溶液并于20°搅拌混合物3小时。蒸发后，将残余物浸溶于水中，用稀HCl酸化至pH3并用乙酸乙酯萃取。用Na2SO4干燥萃取物，再次蒸发，得到的BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala-OH与20ml2N HCl在二恶烷中于20°搅拌2小时。蒸发混合物，将得到的H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala-OH溶于1800ml二氯甲烷和200ml DMF的混合物中并冷却至0°，搅拌下相继加入0.5g DCCI，0.3g HOBt和0.23ml N-甲基吗啉，再于0°搅拌混合物24小时和于20°搅拌混合物48小时。浓缩溶液并用混合床离子交换剂处理以除去盐。然后过滤，蒸发溶液，通过色谱法纯化残余物，得到环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala)M+646(FAB);用类似的方法得到下列化合物环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);M+660;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);M+646;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);M+660;环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);M+632;环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);M+645;环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala);M+646;环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly);M+632;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);M+630;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);M+630;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);M+644;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);M+644;环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val);M+575;环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val);M+589;环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);M+575;环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val);M+589;环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);M+575;环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val);M+575;下面的实施例涉及含有式Ⅰ化合物或其酸加成盐的药物组合物。实施例A片剂按照通常的方法将1kg环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala)，10kg乳糖，6kg微晶纤维素，6kg马铃薯淀粉，1kg聚乙烯吡咯烷酮，0.8kg滑石和0.1kg硬脂酸镁的混合物压制成片，使得每片含10mg活性化合物实施例B包衣片剂按照类似于实施例A的方法压片，然后按照通常的方法用蔗糖、马铃薯淀粉、滑石、黄蓍胶和着色物质包衣。实施例C胶囊按照常规的方法用环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala)填装硬明胶胶囊，使得每个胶囊中含有5mg活性化合物。实施例D安瓿对1kg环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly)于30l1，2-丙二醇的溶液进行无菌过滤，将溶液装入安瓿，进行无菌密封，每个安瓿含2mg活性化合物。实施例E软膏在无菌条件下将500mg环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly)与99.5g矿脂混合。实施例F注射药瓶将100g环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly)和5g磷酸氢二钠于3l双蒸馏水中的溶液用2N盐酸调至pH6.5，无菌过滤，装入注射药瓶并在无菌条件下冻干，以无菌的方式封闭药瓶。每个注射药瓶中含有5mg活性化合物。可用类似的方法得到含有式Ⅰ(a)-(q)的其它活性化合物之一和/或其生理上可接受的酸加成盐的药物组合物。用做过一般性或具体描述的本发明的反应物和/或操作条件代替前述实施例中的反应物和/或操作条件重复前述实施例可取得同样的成功。根据前面的描述，本领域的技术人员可容易地弄清本发明的基本特征，在不违背本发明的精神和不脱离本发明的范围的情况下，可对本发明做各种变动和改进，从而使之适合各种不同的用途和情况。权利要求1.一种药物组合物，包括至少一种可有效地抑制动物细胞粘着量的式Ⅰ(a)-(r)的环肽(Ⅰ)(a)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala)；(b)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala)；(c)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala)；(d)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala)；(e)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly)；(f)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly)；(g)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala)；(h)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly)；(i)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly)；(j)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly)；(k)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala)；(l)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala)；(m)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)；(n)环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)；(o)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)；(p)环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)；(q)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)；(r)环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)，或其生理上可接受的盐；和一种药物上可接受的载体。2.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的动物细胞是哺乳动物的体细胞。3.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的动物细胞是癌细胞。4.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的组合物含有0.05-500mg所说的环肽。5.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的组合物含有0.5-100mg所说的环肽。6.一种治疗和预防血栓形成、心肌梗塞、中风、动脉硬化、炎症、心绞痛和/或肿瘤的方法，包括施用根据权利要求1的组合物。7.根据权利要求6的方法，其中所说的环肽的每日用量为0.01-2mg/kg体重。8.一种诱导受治疗者中粘着一受体拮抗作用的方法，包括给所说的受治疗者施用根据权利要求1的组合物。9.根据权利要求8的方法，其中所说的环肽的每日用量为0.01-2mg/kg体重。10.根据权利要求8的方法，其中所说的环肽是环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala;环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);或环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val).11.根据权利要求6的方法，其中所说的环肽是环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala;环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);或环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val).12.一种阻碍β3integrin血纤维蛋白原结合的方法，包括施用有效量的式Ⅰ(a)-(r)的环肽(Ⅰ)(a)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala);(b)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);(c)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);(d)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);(e)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);(f)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);(g)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala);(h)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly;(i)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);(j)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);(k)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);(l)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);(m)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val);(n)环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val);(o)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);(p)环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val);(q)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);(r)环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val).13.一种治疗或预防骨质疏松的方法，包括施用根据权利要求1的组合物。14.一种抑制破骨细胞形成中细胞粘着的方法，包括施用根据权利要求1的组合物。15.在伤口愈合组合物中，改进之处包括所述组合物含有至少一种式Ⅰ(a)-(r)的环肽(Ⅰ)(a)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Ala);(b)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Ala);(c)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-D-Ala);(d)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-D-Ala);(e)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-Gly);(f)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu-Gly);(g)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Ala);(h)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-Gly);(i)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Gly);(j)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Gly);(k)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Ala);(l)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Pro-Ala);(m)环(-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val);(n)环(-Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val);(o)环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);(p)环(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val);(q)环(-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);(r)环(-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)，或其生理上可接受的盐。全文摘要包括至少一种式I(a)—(r)的环肽或其盐的药物组合物可用作细胞粘着抑制剂。文档编号C07K14/78GK1084408SQ9310801公开日1994年3月30日 申请日期1993年7月6日 优先权日1992年7月6日发明者A·琼泽克, G·霍尔兹曼, B·费尔丁-哈伯曼, G·梅尔泽, B·迪芬巴赫, D·A·彻里希, H·凯斯勒, M·格拉思, G·马勒 申请人:默克专利股份有限公司