碱性氨基酸的一种提纯方法

专利名称：碱性氨基酸的一种提纯方法技术领域：本发明涉及碱性氨基酸的一种提纯方法，这种氨基酸以发酵的方法生产并含有蛋白质-基杂质。碱性氨基酸，例如L-精氨酸，是用发酵的方法生产的。在一种提纯这类氨基酸的方法中把发酵肉汤，在除去细胞后或者直接装到离子交换树脂中吸收碱性氨基酸，并经过洗脱随后直接结晶或经过用活性碳脱色。发酵肉汤含有各种杂质，包括水溶性蛋白质。水溶性蛋白质被吸吸到离子-交换树脂上，然后用碱性洗脱剂与碱性氨基酸一起洗脱。它们在随后的结晶阶段沉淀出来，这样使杂质难于除去。相应地传统的去除方法使用一种工艺，在该工艺中把一种蛋白质促凝剂加入到氨基酸的水溶液中，并把混合物加热用以凝结蛋白质，然后将其滤掉。碱性氨基酸主要用作药物的原料，例如用于营养制剂中，包括氨基酸注射液或中和剂，并且通常使用时的pH值在中性至弱酸性。不过，当碱性氨基酸被溶解而形成水溶液时，同时调整其在中性和弱酸性之间然后用过滤法经过一膜滤器灭菌时，过滤的速度会显著地下降。这里膜滤器是指用于灭菌的微过滤膜，其孔径从0.22-1.0μm。本发明的目的是提供一种提纯碱性氨基酸的方法，该方法用膜滤器过滤处理含碱性氨基酸的中性或弱酸性水溶液时也不会引起过滤能力降低的问题。在作出努力解决上述问题时，我们发现，由于碱性氨基酸是碱性的，使用普通的提纯方法不能有效地除去象蛋白质类的杂质，因而这些杂质仍然在酸性pH值下经历沉淀作用，结果是阻滞了过滤过程。由于不论是中性的和酸性的氨基酸还是碱性氨基酸，大多数氨基酸产物呈盐的形式，因此，它们的水溶液被过滤提纯是在pH值从中性到弱酸性之间进行的。在中性或弱酸性水溶液中，胶体物质，例如蛋白质趋向于凝结，从而便于用过滤法除去。但是，对于不是盐形式的碱性氨基酸来说，其水溶液是碱性的，胶体物质很少凝结并且偶会通过过滤器。此外，碱性的条件能使蛋白质的溶解度提高，其中的一些呈溶解态。已经发现蛋白质的这种性能和其它杂质会引起如上文所述的碱性氨基酸的碱性水溶液过滤困难。因此，为了提高在中性和弱酸性pH值之间的过滤作用，必须完全除去如上述性能的物质并除去在碱性条件下溶解而在酸性条件下沉淀的物质。除去这类物质的一种方法是用诸如盐酸之类的一种酸中和碱性氨基酸的碱性水溶液，然后用膜滤器过滤该中和的溶液。但是，这种方法不适于作为获得碱性氨基酸的碱性水溶液或结晶的方法，因为这需要中和作用的酸并且需要用离子交换树脂处理去除阴离子成份例如氯离子。因此，我们尝试用一种超滤膜(孔径从0.002到0.1μm)，该膜通常用于去除药用氨基酸中的热原，药用氨基酸用作注射液的原材料，该膜的孔径小于微过滤中膜滤器中的孔径，在结晶阶段之前的提纯阶段使用该膜，以便除去前文中所述的杂质。但是，尽管使用了具有比膜滤器孔径小得多的超滤膜，但是溶解有所得的碱性氨基酸并且pH值调整在从中性到弱酸性之间的水溶液的过滤性设有显著地改善。因此，我们进一步研究开发高效率的过滤方法并最后发现，使用一种最近开发出来的紧密-超滤膜的过滤方法最适合于本目的，从而确定了本发明。因此，本发明涉及提纯碱性氨基酸的方法，其中，由发酵方法产生的碱性氨基酸的水溶液用紧密-超滤器膜过滤。适用于本发明的方法的碱性氨基酸不受特别地限制，包括了L-赖氨酸，L-精氨酸，L-鸟氨酸，L-组氨酸，等等。本发明的方法对于水溶液是强碱性的并且能够用结晶的方法提纯的情形最有效，因而，从这一观点看，L-精氨酸、L-赖氨酸和L-鸟氨酸是优选的，而L-精氨酸是更优选的。优选让氨基酸的碱性水溶液处于在某种程度上被提纯的物理和化学状态，因为那些含有诸如细胞等大量不溶物质的，例如发酵肉汤，不能有效地被过滤。优选的这类例子有一种洗提液，通过如下方法获得把在发酵肉汤中的碱性氨基酸吸收到阳离子树脂中，随后除去未吸收的溶液，再用一种碱的水溶液，例如氢氧化钠水溶液洗脱；通过用活性碳的脱色作用从这种洗脱液中获得一种脱色的溶液，一种溶解有粗晶的水溶液，该粗晶通过从这种洗脱液中结晶碱性氨基酸获得，通过使用活性碳对这种粗晶的水溶液脱色而获得一种脱色的溶液；以及通过向这种粗晶水溶液加入蛋白质凝结剂然后用活性碳脱色而获得一种脱色的溶液。碱性氨基酸的碱性水溶液的pH接近于等电位pH，通常在等电位pH±0.5的范围内。碱性氨基酸在水溶液中的浓度优选为低于过滤进行时的温度下的氨基酸的饱和溶解度，该温度的确定基于避免碱性氨基酸的热分解和紧密-超滤膜的可允许的温度。为了更易于操作，优选使浓度接近于饱和溶解度的浓度。例如，当通过紧密-超滤膜在40℃过滤L-精氨酸的水溶液时，L-精氨酸的浓度优选为从20到30克/分升，因为L-精氨酸在40℃时的饱和溶解度大约为35克/分升。就分离分子量而言，紧密-超滤膜是一种被认为介于超滤膜和反渗透膜之间的中间膜，其分离分子量的范围从几百到几千。NaCl排斥率被经常用来表示一种膜的分离性能。本发明所用的紧密-超滤膜的NaCl排斥率为1到50％，优选5到30％，膜的材料可以是乙酰纤维素、聚酰胺、聚苯并咪唑-或聚砜为基质的材料。就过滤条件而言，温度为5-95℃，优选为20到60℃。虽然在所用的具体超滤膜允许的压力限度内，压力可以任意选择，但优选压力还是要考虑到其效率，因为太低的压力延长了过滤时间。一般压力使用的范围从5到100kg/cm2。至于过滤装置，任何市场上所售的都可以使用。用发酵法生产的并含有蛋白质杂质的碱性氨基酸的碱性水溶液用紧密-超滤膜过滤，在水溶液中分子量大于分离分子量的胶颗粒和水溶性蛋白质仍然未通过过滤器，而碱性氨基酸却通过了，从而实现了分离。实施例1依据在日本公开专利申请02-186995(1990)中的实例中描述的方法，培养出一种细菌Brevibacterium flavum AJ12429(FERM BP-2227)并得到25千升L-精氨酸发酵液体(L-精氨酸含量750千克)。这种发酵肉汤的pH用盐酸调整到从6.5至7，然后用离心法分离出细胞。再把去除细胞的溶液装到一种阳离子交换树脂(MITSUBISHICHEMICAL Co.，Diaion SK-1B，树脂床6千升)中以吸收L-精氨酸，然后用8千升水冲洗。随后，加入1N的NaOH水溶液洗脱L-精氨酸。洗脱液在减压下浓缩至1千升体积，然后冷却到10℃，从而结晶出L-精氨酸的二水合物。这样获得的结晶体用离心法分离得到600kg的粗晶体(L-精氨酸的二水合物，L-精氨酸含量480kg)。600kg的这种粗晶溶于纯水中，使其体积为2500升，温度为60℃。这样获得的溶液用0.5升10％的一种蛋白质凝结剂，洁尔灭(Benzalkonium chloride)(Kao Sanyzol)的水溶液相混合，混合物搅拌1小时，加入6kg活性碳之后，混合物再搅拌45分钟。然后，脱色的溶液预涂有硅藻土的陶瓷过滤器过滤，在60℃再加入500升纯水并连续过滤，以回收在过滤器中的残渣。这样所获得的脱色溶液的体积为3000升。这种脱色溶液分别用一种传统的方法，超滤法(UF-法)和本发明的方法(L-RO-法)提纯以获得相应的提纯结晶产物，超滤法作为对比例。[传统方法]1000升的脱色溶液经0.5μm膜滤器过滤后减压浓缩(680mmHg)至300升体积，以便有效地结晶。浓缩的浆被送到一结晶器中，冷却至10℃同时搅动，然后分离所得的晶体。分离出的晶体用少量无-热原水冲洗。所得的湿的提纯晶体为170kg。然后，用一锥形干燥器减压干燥(720mmHg)该湿的提纯晶体，同时在12小时内逐步把温度从65℃升到95℃。干燥的提纯的晶体为136kg。(超滤法)1000升脱色溶液用一种超滤膜(NTU-3250，NITTO DEKO Co.，分离分子量(对蛋白质)大约为6000)，在下列条件下过滤。UF条件压力2kg/cm2流速10升/分温度25至30℃脱色溶液的过滤继续进行直到浓缩的溶液(被处理的溶液)的体积变为2.5升时止，然后用10升纯水再过滤以回收的L-精氨酸。透过的体积1010升。这种透过的溶液经过一种类似于传统的方法经0.5μm膜滤器过滤处理，得到了一种干燥的晶体。所得的干燥的提纯的晶体为135kg。将1000升脱色溶液用一种紧密-超滤膜过滤，该膜用带有磺酰基的合成树脂制成(NTR-7410，NITTO DENKO Co.，NaCl排斥率10％)，过滤条件如下(L-RO条件) 压力 10kg/cm2流速 10升/分温度 25至30℃脱色溶液的过滤继续进行，直到浓缩的溶液(被处理溶液)的体积变为2.5升时为止，然后用10升的纯水继续再过滤以回收仍留存的L-精氨酸。透过的溶液体积为1010升。这种透过的溶液经过一种类似在传统方法中经0.5μm膜滤器的过滤处理，得到一种干燥的晶体。得到的干燥的提纯的晶体的为136kg。用上述三种方法得到的干燥的提纯的晶体在下列条件下过滤以便比较其过滤性能。用2N盐酸水溶液调整pH，其过滤性能用过滤所要求的时间长短来评价。结果列于表1中。(过滤性能评价的条件)压力2kg/cm2L-精氨酸浓度5g/分升温度30℃过滤的体积 1.4升过滤膜 微孔0.22μm GSpH 11，7，5，3表1在各pH时水溶液的过滤时间(秒)提纯晶体的溶液 pH11 pH7 pH5 pH3传统的方法 1010 1510 8000 阻塞UF-法 8501400 2640 阻塞L-RO法930 910 880 920用传统方法和UF-法得到的提纯结晶在pH值从中性到酸性表现出极差的过滤性，特别是在pH值为3时。另一方面，用L-RO法(本发明的方法)得到的提纯晶体在pH值从中性到酸性却没有表现出变劣的过滤性。实施例2取1000升按与实施例1相同的方法制取的脱色溶液，用L-RO方法，使用非填充紧密-超滤膜(HR-20，Toray，NaCl排斥率15％)在下列条件下处理(L-RO条件)压力 25kg/cm2流速 12升/分温度 20至25℃脱色溶液的过滤继续进行，直到浓缩的溶液(被处理的溶液)的体积变为2.5升为止，然后用10升纯水继续再过滤，以回收仍留存的L-精氨酸。透过的容积为1020升。这种渗过液用在传统方法中用经0.5μm膜滤器相同的过滤处理后，得到一种干燥的晶体。所得的干燥的提纯的晶体量为132kg。用上述方法获得的干燥的提纯的晶体，在与例1中相同的条件下过滤，以评价其过滤性能。结果列于表2中。表2在各pH值时水溶液的过滤时间(秒)pH11 pH7 pH5 pH3用L-RO法提纯的晶体水溶液921918 920 914使用本发明的方法，避免了过滤性能下降的问题，甚至当碱性溶液中的碱性氨基酸在pH值从中性到酸性的范围内进行过滤也如此。权利要求1.一种碱性氨基酸的提纯方法，其中，用发酵法生产的氨基酸的碱性水溶液用一种紧密-超滤膜过滤。2.根据权利要求1的氨基酸的提纯方法，其中，所述氨基酸选自L-精氨酸、L-赖氨酸和L-鸟氨酸。全文摘要本发明的目的是提供一种提纯碱性氨基酸的方法，该方法甚至在用过滤法处理中性或酸性氨基酸水溶液时仍不会引起过滤性变劣的问题。提纯碱性氨基酸的方法，其中发酵法生产的氨基酸的碱性水溶液是用紧密-超滤膜过滤的。文档编号C07C277/00GK1132741SQ9512052公开日1996年10月9日 申请日期1995年11月30日 优先权日1994年11月30日发明者金儿丰一, 久光邦夫 申请人:味之素株式会社