一种碱性蛋白酶抑制剂、筛选方法及其应用

本发明属于生物技术和药物研发领域，涉及一种碱性蛋白酶抑制剂、筛选方法及其应用。

背景技术：

1、蛋白酶是一种在温和条件下高效催化的酶，不仅能够水解大分子蛋白质的肽键，还可用于多肽和酯基的合成。在工业中，蛋白酶是一类广泛应用的酶制剂，其年销量占据世界酶制剂市场60％以上。碱性蛋白酶作为蛋白酶家族中的关键成员，在极端碱性环境下表现出色，被广泛应用于食品、纺织、医药、洗涤等多个行业。例如，为了去除衣物和餐具上存在的蛋白类污垢，需要在洗衣液和洗碗液中添加碱性蛋白酶，从而使碱性蛋白酶的需求量非常大。

2、但碱性蛋白酶特性决定了它们在高密度发酵和贮存条件下会发生自切，从而使其失活，且其酶活损失随时间延长而急剧增加。因此，在高密度发酵和存储运输过程中添加碱性蛋白酶抑制剂来抑制其酶活是常用的保护策略。通过文献调研发现诺维信目前主要使用的蛋白酶稳定剂是4-甲酰苯基硼酸和丙二醇复合物。

3、在合适的条件下4-甲酰苯基硼酸和丙二醇形成一复合物，此复合物可以结合到蛋白酶的活性点，从而有效抑制蛋白酶的活性。但是在高密度发酵实验过程中发现，4-甲酰苯基硼酸和丙二醇形成的复合物不稳定，非常容易分解，分解之后的丙二醇会被细菌当做碳源吸收，从而不能很好地抑制蛋白酶活性。

4、针对此关键科学问题，本研究拟基于此抗自剪切原理，以4-甲酰苯基硼酸和丙二醇形成的复合物为模型，在数据库中搜索结构相似的化合物，通过分子对接和分子动力学模拟，发现可以抑制碱性蛋白酶自切的新化合物，从而实现碱性蛋白酶的高密度发酵。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，通过分子对接和分子模拟，筛选出能抑制芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶自切的抑制剂。

2、实现本发明的技术路线概述如下：

3、本发明为得到具有抑制碱性蛋白酶自切的抑制剂，提供了基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在抑制剂试验方法。

4、本研究以筛选出的抑制剂为配体分子，通过查阅碱性蛋白酶其活性氨基酸位点，确定结合口袋，将结合口袋作为对接区域进行分子对接，得到结合能最低的化合物；通过分子动力模拟对分子对接的结果进行验证；最后使用选取的化合物进行后续的体外细胞实验进行进一步筛选。希望通过分子对接和分子动力学模拟筛选出能够显著抑制碱性蛋白酶自切的化合物。步骤如下：

5、(1)利用chembio 2d软件画出4-甲酰苯基硼酸和丙二醇形成的复合物的结构，在arthor网站上搜索与该化合物结构相似的分子。在zinc网站上找和4-甲酰苯基硼酸结构相似的化合物。

6、(2)以结构和元素为标准对搜索结果进行初筛，确定用于下一步对接的分子。

7、(3)使用autodock进行对接，综合分析结合位置和结合能，筛选小分子。

8、(4)将上一步筛选出来的分子与碱性蛋白酶进行动力学模拟，确定用于实验检测的分子。

9、(5)进行体外实验，测定小分子抑制效果，筛选抑制效果最好的分子。

10、本发明的有益效果是

11、(1)通过基于抗自剪切原理，结合分子对接和分子对力学模拟，经过多轮筛选，得到有效抑制碱性蛋白酶自切的抑制剂。

12、(2)其中4-乙酰基苯硼酸在90天后还能使相对酶活稳定在70％以上，有望应用在高密度发酵和存储运输过程中保护碱性蛋白酶。

技术特征：

1.一种碱性蛋白酶抑制剂，其特征在于为4-乙酰基苯硼酸，所述4-乙酰基苯硼酸可以紧密结合在碱性蛋白酶的活性位点，抑制碱性蛋白酶的自切。

2.一种筛选抑制剂的方法，其特征在于基于抗自剪切原理，结合分子对接和分子模拟进行筛选。

3.权利要求1所述的碱性蛋白酶抑制剂在医药、生物、化工等行业的应用。

4.如权利要求1所述的碱性蛋白酶抑制剂，其特征在于所述碱性蛋白酶为芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶。

技术总结本发明公开了一种碱性蛋白酶抑制剂、筛选方法及其应用。本发明利用分子对接和分子动力学模拟方法结合体外实验进行筛选，发现4‑乙酰基苯硼酸(4‑Acetylphenylboronic acid,CAS号：149104‑90‑5)可以稳定结合在碱性蛋白酶的活性位点，具有抑制碱性蛋白酶自切的能力，可以有效避免产品中的蛋白酶在贮存过程中被蛋白酶所分解，从而保证含酶的液体洗涤剂在贮存过程中酶不失活。技术研发人员：刘夫锋,路福平,吴新明,贾莉受保护的技术使用者：天津科技大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18