蛋白质-纳米颗粒偶联物纯化方法与流程

背景当与蛋白质偶联时，纳米颗粒(例如，如美国专利申请号2012/0282632中所述的聚合物点和量子点)是有用的报告分子。蛋白质和纳米颗粒之间的偶联反应通常使用摩尔过量的蛋白质进行，以确保最佳的偶联比率。偶联后，需要将偶联物与剩余的游离蛋白质分离，因为未偶联的蛋白质可能会干扰例如使用偶联物的测定。尺寸排阻色谱(sec)和离心已用于将偶联物与过量的游离蛋白质分离。sec需要使用昂贵的尺寸排阻树脂填充大柱。离心仅可应用于与其中悬浮纳米颗粒的介质相比相对致密的纳米颗粒。离心后，纳米颗粒偶联物也可形成可能不易分散的团块。技术实现要素：提供了纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的方法。在一些实施方式中，该方法包括使蛋白质-纳米颗粒偶联物，游离蛋白质和缓冲剂的混合物与多模式(multimodal)介质接触以将蛋白质-纳米颗粒偶联物与游离蛋白质分离，其中多模式介质具有尺寸排阻模式和捕获模式；并且从介质中收集蛋白质-纳米颗粒偶联物，从而纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物。在一些实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有包埋在其中的羟基磷灰石微晶。在一些实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有用疏水且带正电荷的配体官能化的芯。在某些实施方式中，配体中的一个或多个是辛胺。在一些实施方式中，介质还包含基于多糖的外壳。在某些实施方式中，多糖是琼脂糖。在一些实施方式中，外壳包含琼脂糖。在一些实施方式中，多模式介质包含丙烯酰胺。在一些实施方式中，纳米颗粒是聚合物点(p-dot)。在一些实施方式中，p-dot的直径为5-100nm并且是胶体半导体聚合物。在一些实施方式中，p-dot是荧光的。在一些实施方式中，混合物还包含游离纳米颗粒，并且介质将游离纳米颗粒与偶联物分离。在某些实施方式中，混合物包含表面活性剂。在一些实施方式中，表面活性剂是pluronicf68和/或聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，混合物中的表面活性剂浓度为0.02％-1.0％。在某些实施方式中，所述蛋白质是抗体。在一些实施方式中，该抗体是igg抗体。在一些实施方式中，收集步骤包括从介质中收集富含蛋白质-纳米颗粒偶联物的一个或多个级分。在某些实施方式中，收集步骤包括向介质施加离心力或真空，并从介质中收集富含蛋白质-纳米颗粒偶联物的一个或多个级分。在一个实施方式中，用于从游离蛋白质纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的试剂盒包括柱(例如旋转柱)和具有尺寸排阻模式和捕获模式的多模式介质。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含至少一种由以下组成的组分：纳米颗粒，缓冲剂，表面活性剂，偶联剂，以及用于实施从游离蛋白质纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的方法的说明书。具体实施方式本发明人发现了一种新的色谱介质和条件的组合，其允许从游离蛋白质(例如，游离抗体)中分离蛋白质-纳米颗粒偶联物(例如，抗体-聚合物点偶联物)。i.定义术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段形式。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的iga、igd、ige、igg和igm型的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。“抗体”包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也包括抗体片段，如fab、f(ab′)2、fv、scfv、fd、dab、fc和其它组合形式，无论它们是否保留抗原结合功能。术语“蛋白质”用于指氨基酸聚合物或一组两种或更多种相互作用或结合的氨基酸聚合物。该术语可应用于某种氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物，以及天然产生的氨基酸聚合物(含有经修饰的残基的聚合物)和非天然产生的氨基酸聚合物。ii.方法现在将描述纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的方法。在一个实施方式中，该方法包括使蛋白质-纳米颗粒偶联物，游离蛋白质和缓冲剂的混合物与多模式介质接触以将偶联物与游离蛋白质并任选地与游离纳米颗粒分离。据信，本文所述的纯化方法可以应用于多种蛋白质-纳米颗粒偶联物。在一些实施方式中，所述蛋白质是抗体。例如，在一些实施方式中，抗体是iga，igd，ige，igg和igm抗体。在一些实施方式中，抗体是结合抗原的抗体片段，例如fab，f(ab′)2或fv，或包含此类片段的融合蛋白。在一些实施方式中，抗体是单链抗体，例如scfv，一种或多种抗体的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合体。抗体可以是重组的或天然存在的。抗体可以是人，小鼠，大鼠，兔，牛，山羊，骆驼，美洲驼抗体或来自其他产生抗体的物种。纳米颗粒是尺寸为纳米级的颗粒，例如约1nm至约1000nm。在一些实施方式中，颗粒在1-300nm，5-500nm或10-50nm之间。许多纳米颗粒的形状大致为球形，形成球形颗粒的半径或直径尺寸。流体动力学半径或直径也可用于限定纳米颗粒尺寸。在一些实施方式中，纳米颗粒是荧光半导体聚合物点(pdot)。此类pdot的示例描述于例如wu，c.等，chem.mater.21：3816-3822(2009)；rahim，n.a.a.等，adv.mater.21：3492-3496(2009)，rong等，acsnano7(1)：376-84(2013)；专利公开us2013/0266957；wo2012/054525；和us2012/0282632。通过将聚合物塌缩成稳定的亚微米尺寸的颗粒可以产生发色的pdot。本发明提供的pdot纳米颗粒可通过本领域用于塌缩聚合物的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法、依赖乳液(如细乳液(miniemulsion)或微乳液(microemulsion))形成的方法和依赖缩聚的方法。pdot纳米颗粒尺寸取决于用于产生pdot的聚合物的分子量(参见，例如，zhang，y.等，chemsci.6(3)：2102-2109(2015)和美国专利9382473)。在一些实施方式中，每种pdot的分子量为约500,000道尔顿至约15,000,000道尔顿，或约1,800,000道尔顿至约7,000,000道尔顿。可用于本文所述方法的其他示例性纳米颗粒包括但不限于磁性纳米颗粒，量子点和金纳米颗粒。磁性纳米颗粒是一类可以使用磁场梯度操纵的纳米颗粒。磁性纳米颗粒由磁性或顺磁性元素形成，包括但不限于铁，镍和钴及其化学化合物。量子点是由无机半导体材料形成的纳米颗粒。金纳米颗粒(例如，胶体金)具有有助于生物医学应用的光学性质，并且描述于例如huang，x.等，journalofadvancedresearch1(1)：13-28(2010)。可以根据需要将纳米颗粒官能化以将纳米颗粒与蛋白质连接。纳米颗粒的示例性官能化描述于前述美国专利公开号2012/0282632中。作为示例，纳米颗粒可以被官能化以呈现一个或多个羧酸部分，其又可以用于将一个或多个接头连接至蛋白质。偶联物组分(例如，蛋白质和纳米颗粒)可以共价或非共价连接。非共价连接的示例是生物素-链霉亲和素亲和连接，其中偶联物的一个成员是生物素化的，而偶联物的另一个成员与链霉亲和素连接。连接选项的其他示例包括但不限于纳米颗粒与蛋白质胺的直接偶联；用马来酰亚胺修饰纳米颗粒并随后与具有暴露的巯基基团的蛋白质连接(例如通过用巯基乙胺或2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特(traut′s)试剂)处理蛋白质产生)；用肼修饰纳米颗粒并与具有氧化聚糖(醛)的蛋白质连接；或使用点击化学(例如，用紧张的炔烃修饰纳米颗粒并与用叠氮化物修饰的蛋白质连接)。可以使用任何类型的偶联方法将蛋白质偶联至纳米颗粒。通常，为了产生所需的偶联物产量，在偶联反应中提供过量的蛋白质。这可以在偶联反应后产生大量游离的(未偶联的)蛋白质。在一些实施方式中，在反应混合物中还存在一定量的游离的未偶联纳米颗粒。本文描述的方法可用于从偶联反应的游离未偶联成员中纯化偶联物。在一些实施方式中，施加试剂，其将与剩余的反应性基团反应并防止进一步反应。作为示例，马来酰亚胺官能化的纳米颗粒与硫醇化或还原的蛋白质之间的偶联将用烷基化试剂停止或猝灭，所述烷基化试剂包括但不限于n-乙基马来酰亚胺。附加nhs的纳米颗粒和蛋白质之间的反应将用胺(包括但不限于乙醇胺)停止或猝灭。一旦进行偶联，就调节所得的偶联混合物(例如，纳米颗粒/蛋白质偶联物，未反应的游离蛋白质和任选的游离纳米颗粒)以建立适当的ph，电导率和/或盐浓度。可以通过例如用色谱树脂平衡缓冲液交换偶联缓冲液来对偶联混合物进行调节。示例性缓冲化合物包括但不限于磷酸盐，hepes，mes和tris。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含hepes，其量为约10mm至约30mm(例如，10mm，20mm或30mm)。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含的磷酸盐(po43-)的量为约5mm至约50mm(例如，5mm，10mm，25mm)。在某些实施方式中，平衡缓冲液的ph范围为约5至约8(例如，约6，约7或约8)。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含至少10或100mmna+或k+(例如，10至150mm，20至200mm，或100至300mm)。在某些实施方式中，平衡缓冲液是ph7.3的20mmhepes-koh。在一些实施方式中，平衡缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs＝10mm磷酸钠，150mm氯化钠，ph7.8)。混合物中还可包含一种或多种表面活性剂。可以包括足够量的表面活性剂以防止偶联物从混合物聚集和沉淀，特别是在引入高离子强度缓冲液时，否则可能导致偶联物的聚集或沉淀。在一些实施方式中，表面活性剂是非离子型聚亚烷基二醇表面活性剂，例如聚乙二醇。在一些实施方式中，表面活性剂是含聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特点是，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧接两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。因为聚合物嵌段的长度可以定制，所以存在许多不同的泊洛沙姆，其具有略微不同的性质。泊洛沙姆共聚物的常用命名采用“p”(表示泊洛沙姆)后跟三个阿拉伯数字，前两个阿拉伯数字×100即是聚氧丙烯芯的大致分子量，最末阿拉伯数字×10即是聚氧乙烯的含量百分比(例如，p407＝这样的泊洛沙姆，其具有4,000g/mol的聚氧丙烯分子量和70％的聚氧乙烯含量)。对于pluronic和synperonic泊洛沙姆的商品名，这些共聚物的编码以字母开始，以定义其在室温下的物理形式(l＝液体，p＝糊剂，f＝薄片(固体))，然后是两位或三位数。数字标记中的第一位数(三位数字中的两个数字)乘以300表示疏水链的近似分子量；最后一位数×10给出聚氧乙烯含量百分比(例如，f-68表示聚氧丙烯分子量为1800g/mol，聚氧乙烯含量为80％)。示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于pluronicf-68。所用表面活性剂的浓度可凭经验确定(即，滴定使得不发生偶联物的沉淀)。在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为0.02％-1％，例如0.05-0.2％，例如0.1％。在将偶联物混合物与多模式介质接触之前，可以平衡介质以建立适当的ph，电导率和/或盐浓度。多模式介质具有尺寸排阻模式和捕获模式。尺寸排阻模式基于它们的尺寸或分子量来分离分子，复合物或颗粒。介质具有这样的孔，使得超过特征性尺寸阈值的分子，复合物或颗粒无法进入孔中并被收集在空隙体积，排除体积或色谱柱流穿物中。较小的蛋白质和其他分子可以进入介质的孔并被介质捕获。如本文所用，介质的截留分子量大小是指能够进入孔的蛋白质或分子的大致尺寸。例如，分子量截留尺寸50kda意味着大小约为50kda或更小的分子可以进入介质的孔隙，而大约超过50kda的分子将被排除在孔之外。基于介质内的配体(例如，在介质的孔内或在基于珠的介质的芯内)或介质内的带电基团，捕获模式捕获或结合保留在介质内的分子。因此，当偶联物和游离蛋白质的混合物与多模式介质接触时，排除大的偶联物进入介质的孔并收集在空隙体积中。足够小以进入孔的游离蛋白质(和任选的游离纳米颗粒)被介质内的配体或介质中的带电基团捕获。如本文所用，术语配体是指通过一种或多种结合模式与所施用的蛋白质结合的实体，所述结合模式包括但不限于静电，疏水，范德华力，金属亲和性，氢键和共价相互作用。静电相互作用由带电基团介导，所述带电基团与例如基于疏水和静电力与蛋白质相互作用的蛋白质或染料上带相反电荷的分子结合。示例性带正电荷的基团包括但不限于胺基，酰胺基或能够带正电荷的其他基团。示例性带负电荷的基团包括但不限于羧酸，羟基，巯基，磷酸酯，磺酰基或能够带负电荷的其他基团。疏水相互作用由非极性基团如烷基链和芳族基团介导。配体可通过多种结合模式与蛋白质结合。示例包括染料结合，其中蛋白质可通过离子，疏水和氢键相互作用与固定的染料结合。示例性染料描述于例如tamburro，d，等，j.am.chem.soc.，133，19178-19188(2011)并且可以包括蒽染料(例如，茜素蓝黑b，分散蓝3，酸性黑48)，蒽醌染料(雷马唑亮蓝r，颜料红177)，二硝基苯染料(分散黄3，分散黄9)，苯胺染料(分散橙3，酸性黑1，酸性蓝22，副胭脂红碱)，罗丹明123，甲苯胺蓝0，吲哚菁绿，汽巴蓝f3ga，三苯甲烷染料(如蓝)，三芳基甲烷染料和曙红染料。通过多种结合模式结合蛋白质的配体的另一个示例是羟基磷灰石，其通过离子和金属亲和相互作用结合蛋白质(gorbunoff，m.j.和timasheff，s.n.anal.biochem.，136，440-445(1984))。在一个实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有包埋在其中的羟基磷灰石微晶。在某些实施方式中，多糖具有排除抗体-纳米颗粒偶联物的孔，并且羟基磷灰石微晶捕获游离抗体(和任选的游离纳米颗粒)。这种多模式介质的市售实例是ha(可从珀尔公司(pall)购得)。如本文所用，“羟基磷灰石”是指包含结构式为ca10(po4)6(oh)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和性。羟基磷灰石可以各种形式商购获得，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石，其是已在高温下烧结的羟基磷灰石的化学纯形式。在一些实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有用疏水且带正电荷的配体官能化的芯。在某些实施方式中，多糖具有排除抗体-纳米颗粒偶联物的孔，并且配体捕获游离抗体(和任选的游离纳米颗粒)。在一些实施方式中，配体是辛胺。在一些实施方式中，所述介质还包含基于多糖的外壳，其具有排除抗体-纳米颗粒偶联物的孔。这种多模式介质的市售实例是captotmcore700(可从ge医疗公司(gehealthcare)购得)。在一些实施方式中，多模式介质中的多糖是琼脂糖。在一些实施方式中，多糖是葡聚糖。在某些实施方式中，多模式介质包含丙烯酰胺。在一些实施方式中，多模式介质包含具有可交联单元的聚合物，并且交联度将决定介质的孔径。在一些实施方式中，多模式介质包含由正-异丙基丙烯酰胺形成的聚合物，并具有用基于染料的亲和配体官能化的芯。包含具有用基于染料的亲和配体官能化的芯的丙烯酰胺的这种多模式介质的示例描述于，例如，美国专利8,382,987；和美国专利9,383,299。多模式介质可用于任何常规的纯化配置，包括但不限于填充柱和流化床或膨胀床柱，以及任何常规色谱方法，包括用于加载，洗涤和洗脱的分批模式，以及连续或流穿模式。在一些实施方式中，将介质填充在直径范围从小于0.5厘米到大于1米的柱中，并且柱高度在小于1厘米至大于30厘米的范围内。在一个实施方式中，介质在一次性旋转柱中提供。将样品施加到旋转柱的顶部并离心或真空迫使样品通过柱。在一些情况下，介质在色谱柱中提供，将样品施加到柱的顶部并且重力迫使样品通过柱。在将蛋白质-纳米颗粒偶联物，游离蛋白质和缓冲剂混合物与多模式介质接触后，从介质中收集蛋白质-纳米颗粒偶联物，从而从游离蛋白质和任选的游离纳米颗粒中纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物。可以根据需要监测来自多模式介质的输出物中偶联物，游离蛋白质或样品的其他组分的存在，以确定含有偶联物且不含或与原始偶联混合物相比至少具有减少量的游离抗体的偶联物的级分。在一些实施方式中，在所得纯化的偶联物级分中除去偶联反应中至少90％，95％，99％的未偶联蛋白。用于测量输出物的示例性方法包括监测纳米颗粒或蛋白质的特征性吸收波长。术语“级分”用于表示色谱输出物的一部分，并不旨在限制输出物的收集方式或输出物是部分收集还是连续收集。iii.试剂盒提供了根据本文所述方法纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含柱(例如，旋转柱)和具有尺寸排阻模式和捕获模式的多模式介质。在一些实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有包埋在其中的羟基磷灰石微晶。在某些实施方式中，多模式介质包含多糖并且具有用疏水且带正电荷的配体官能化的芯。在一些实施方式中，配体是辛胺。在一些实施方式中，多模式介质包含由正-异丙基丙烯酰胺形成的聚合物，并具有用基于染料的亲和配体官能化的芯。在某些实施方式中，试剂盒还包含纳米颗粒(例如，官能化的pdot)，缓冲剂，表面活性剂，用于将蛋白质偶联至纳米颗粒的偶联剂，和/或用于从游离蛋白质纯化蛋白质-纳米颗粒偶联物的说明书。iv.实施例实施例1：使用重力柱纯化igg-聚合物点偶联物该实施例说明使用重力柱从游离igg纯化igg-聚合物点(pdot)偶联物。材料：1.1.5mlcaptotmcore700树脂(ge医疗公司)2.3mlha树脂(vwr目录号87004-866)3.2ml一次性重力柱(thermofisher目录号29920)4.300μl含有未反应的游离igg的山羊抗兔igg-pdot偶联反应混合物。5.柱平衡和洗涤缓冲液1：pbs(150mm氯化钠，10mm磷酸钠，ph7.8)和(0.1％pluronicf68+0.1％peg3350以抑制纳米颗粒聚集)6.洗涤缓冲液2：20mm钾hepesph7.3，0.1％pluronicf68，和0.1％peg3350如下制备三个柱：将1.5mlcaptotmcore700树脂倒入柱1中，并将1.5mlha树脂倒入柱2和3的每一个中。使所有柱中的树脂沉降。柱用柱平衡缓冲液(即洗涤缓冲液1)或洗涤缓冲液2平衡，这取决于树脂(参见表1)。将100μl偶联反应混合物施用于每个柱。根据树脂，用洗涤缓冲液1或洗涤缓冲液2洗脱柱(参见表1)。偶联物中使用的pdot具有棕红色并且具有473nm处的吸光度(或a473)。测定每个柱流穿的体积和a473(即pdot的吸光度)，并用于基于pdot确定产率。通过非变性sds-page分析每个流穿的一部分来确定每个柱流穿中的游离igg。pdot不进入聚丙烯酰胺凝胶；因此，凝胶用于估计每个柱流穿的游离igg的浓度(例如，通过使用光密度测定法以产生测定游离igg浓度的标准曲线)。通过与反应混合物中igg的原始质量相比较，估计的igg浓度用于估计igg清除百分比。参见表1，相对于对照(即，未分级的材料)测定igg-pdot偶联物产率百分比和igg清除或去除百分比(即，100-游离igg百分比)。表1表1中的结果显示，用洗涤缓冲液1的ha的偶联物产率百分比高于使用captocore700的偶联物产率百分比。用ha的偶联物产率百分比对于洗涤缓冲液1和2分别为87％和84％。表1中的结果还显示两种类型的树脂除去或清除了至少90％的游离抗体。该实施例说明了使用具有尺寸排阻模式和捕获模式的两种不同的多模式介质(即，ha和captotmcore700)来从游离igg中纯化igg-pdot偶联物。实施例2：使用旋转柱纯化igg-聚合物点偶联物该实施例说明了使用旋转柱从游离igg中纯化igg-pdot偶联物。材料：1.ha树脂(vwr目录号87004-866)2.一次性旋转柱(thermofisher目录号69705)3.23个样品：含有游离igg的23份山羊抗兔igg-pdot偶联反应混合物。每份偶联反应混合物使用不同批次的pdot。偶联反应混合物含有120-167μgpdot和igg中pdot质量的0.5倍。4.柱平衡缓冲液：20mm钾hepesph7.3，0.1％pluronicf68，和0.1％peg3350通过将200μl浆液(即悬浮在柱平衡缓冲液中的haultragel树脂)移液到空的旋转柱中来制备旋转柱。用柱平衡缓冲液平衡旋转柱，3次重复施加500μl缓冲液，然后以1500×g离心1分钟。将旋转柱塞住并施加每个完整偶联反应。室温孵育1小时后，通过以1500×g离心2分钟收集igg-pdot偶联物。测定每种反应混合物的473nm的吸光度(即，pdot的吸光度)和体积，并用于基于pdot测定igg-pdot偶联物产率。如实施例1中所述，通过非变性sds-page测定每个反应中的游离igg。通过与反应混合物中igg的原始质量相比较，估计的igg浓度用于估计igg清除百分比。表2总结了23份反应混合物的igg-pdot偶联物产率和igg清除率百分比。表2样品igg-pdot偶联物产率(％)igg清除(％)17999.325699.236299.54107(表观)99.458299.566099.676099.187599.597499.5106399.7116799.5124899.11310099.1149099.2155099.1165798.4176998.4187498.5198699.2206999.1217998.4227099.4238899.0表2中的结果显示，用ha的偶联物产率百分比范围为48％至约7％(表观)。偶联物产率百分比的变异性取决于偶联反应混合物中使用pdot的批次。表2中的结果还显示，无论偶联反应混合物中使用的pdot批次如何，从所有样品中清除至少98％的游离抗体。该实施例说明了使用具有尺寸排阻模式和捕获模式的多模式树脂(即，ha)，以使用旋转柱从游离igg纯化igg-pdot偶联物。在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。当前第1页12