表面增强拉曼散射基底及其制备方法和原位快速检测方法与流程

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和原位快速检测方法。

背景技术：

非法添加剂多指代食品中的非法添加剂。一般而言，不属于传统上认为是食品原料的、不属于批准使用的新资源食品的、不属于卫生部门公布的药食两用或作为普通食品管理物质的、未列入各国食品添加剂的和其他法律法规允许使用的物质，都是非法添加剂；例如苏丹红、碱性橙等。液相体系多指饮料、饮用水、水产养殖水、江河湖泊水等液相环境。现有对于液相体系中非法添加剂的检测方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法、固相萃取-高效液相色谱法、紫外分光光度法、酶联免疫吸附法等。传统的检测方法虽然检测精度较高，可重复性好，但存在前处理过程复杂，仪器分析用时较长，检测成本高，不适合现场检测。因此，发展一个简单、快速、有效液相体系中非法添加剂的原位检测方法是至关重要的。

表面增强拉曼散射(surface-enhancedramanscattering,sers)效应是指合适频率的激光照射贵金属纳米颗粒表面时，会激发贵金属纳米颗粒表面的等离子体共振，引起电磁场增强，当待测分子置于此增强的电磁场中时，其拉曼散射信号会增强百万倍甚至更高倍，是一种无损、免标记、高灵敏、近场效应的分析检测手段，被广泛应用于生物、化学、环境等领域。作为一种分子光谱指痕鉴定方法，与其他传统检测方法相比，sers具有快速、操作简便、不需要样品前处理或样品前处理简单等优点，是一种高灵敏度、高时空分辨率、实时无损的检测技术。

实验及理论研究表明，sers技术可在低浓度待测物质上获得高灵敏度的信号，而获得高质量拉曼信号的前提条件是sers活性基底的增强性能，sers基底的材料、形貌等因素决定了sers基底的增强效应。现有sers基底通常通过配置金纳米颗粒溶液，而后将金纳米颗粒溶液滴于衬底上，再经干燥在衬底上形成金纳米颗粒聚集体，制得sers基底。以上方法中通过直接吸取溶液滴于衬底上再进行干燥的方式设置金纳米颗粒聚集体，金纳米颗粒的排布是混乱无序的，使得所形成的sers基底用于待测物的检测时，检测稳定性和信号重现性较差。因此，开发出一种性能优良的sers基底，以用于实现对液相中非法添加剂分子的原位快速检测尤为重要。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和原位快速检测方法，该制备方法制得的表面增强拉曼散射基底可用于液相体系中非法添加剂分子原位快速检测，其灵敏度高，重现性好。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，包括以下步骤：

s1、金纳米颗粒自组装薄膜的制备：向所述金纳米颗粒溶液中加入溶剂，静置分层；所述溶剂与所述金纳米颗粒溶液不互溶，且浮于所述金纳米颗粒溶液的上方；将醇类溶液注入所述金纳米颗粒溶液中，所述金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒转移至所述金纳米颗粒溶液与所述溶剂之间的分界面，并通过自组装形成金纳米颗粒自组装薄膜；

s2、在透明基底上设置至少一层所述金纳米颗粒自组装薄膜，制得表面增强拉曼散射基底。

步骤s1中，金纳米颗粒溶液通常为金纳米颗粒水溶液；金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径一般为10～150nm。溶剂通常为油相溶剂；根据本发明的一些实施例，溶剂为烷烃类有机溶剂，具体可采用己烷、庚烷中的至少一种。溶剂加入金纳米颗粒溶液中会出现油水分层，油相溶剂浮于金纳米颗粒溶液的上方，再通过添加醇类溶液，可使金纳米颗粒的表面电荷降低，以及使油水界面能下降，进而金纳米颗粒可上升转移至油水分界面，并通过自组装形成金纳米颗粒自组装单层薄膜。其中，醇类溶液通常采用乙醇溶液。

步骤s1中，金纳米颗粒溶液可由金盐溶液与还原剂反应制得。根据本发明的一些实施例，所述金纳米颗粒溶液由包括以下步骤的制备方法制得：

a、将还原剂溶液煮沸，加入金盐溶液后进行热回流处理，得到金纳米颗粒种子溶液；

b、向所述金纳米颗粒种子溶液中加入金盐溶液，进行加热处理，制备金纳米颗粒溶液。

通过以上方式所制得金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒尺寸均一，用于制备表面增强拉曼散射基底，可进一步提高其灵敏度、稳定性和重现性。

根据本发明的一些实施例，步骤a中，所述还原剂溶液选自柠檬酸盐溶液；步骤a和/或步骤b中，所述金盐溶液选自氯金酸溶液、氯金酸钠溶液中的至少一种。还原剂溶液的浓度一般为2～2.5mm(即mmol/l)；金盐溶液的浓度一般为20～30mm。另外，步骤a中，热回流处理的时间一般为10～20min。

根据本发明的一些实施例，步骤b具体包括以下步骤：

①向所述金纳米颗粒种子溶液中加入金盐溶液，而后进行加热处理；

②重复步骤①至少一次，得到金纳米颗粒溶液；

或者，还包括：③向步骤②所得的金纳米颗粒溶液中加入还原剂溶液，得到第二轮金纳米颗粒种子溶液；再按照步骤①或步骤①和②，制备含所需粒径金纳米颗粒的金纳米颗粒溶液。通过以上方式或进一步重复步骤③，可根据所需金纳米颗粒的粒径要求制备金纳米颗粒溶液。另外，由于随着轮数的增加，还原剂和金盐溶液不断加入，使得金纳米颗粒不断长大，同时金纳米颗粒溶液的浓度也在不断增加，因此，为了使每轮合成的金纳米颗粒浓度大致相同，可在后期加入还原剂溶液的同时，加入适量水以进行稀释。

以上步骤①中，金盐溶液的浓度一般为20～30mm，加热处理的时间一般为20～30min；步骤③中还原剂溶液的浓度一般为50～70mm。

步骤s1中，金纳米颗粒溶液、烷烃类有机溶剂和乙醇溶液的体积比可为5:5:2。

根据本发明的一些实施例，步骤s2中，所述透明基底为柔性透明基底。采用柔性透明基底制备表面增强拉曼散射基底，在进一步应用于非法添加剂分子时，可根据待检测物的形状灵活改变表面增强拉曼散射基底的包裹形状，以使其上的金纳米颗粒自组装薄膜与待检测物充分接触，进行检测，从而提高检测灵活性和灵敏度。

透明基底的材质具体可采用聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚对苯二甲酸乙二酯(pet)中的至少一种。采用柔性材质，基底质轻，将其用于制备表面增强拉曼散射基底，进而用于液相体系中非法添加剂分子的检测时，可将表面增强拉曼散射基底上含金纳米颗粒自组装薄膜的一侧朝下，与待测溶液的表面贴合接触以进行检测，而由于基底的密度小于待测溶液的密度，基底可悬浮于待测溶液的表面，可实现实时原位检测，不用破坏待检测物或提取待检测物后再滴于基底上，操作简便。

根据本发明的一些实施例，步骤s2中具体采用lb技术(即langmuir-blodgett转移技术)，在透明基底上设置至少一层所述金纳米颗粒自组装薄膜。金纳米颗粒自组装薄膜的层数具体可为2层、3层、4层、5层等；优选为2层。

本发明的第二方面，提供一种表面增强拉曼散射基底，由本发明第一方面的任一种表面增强拉曼散射基底的制备方法制得。

本发明的第三方面，提供一种液相体系中非法添加剂分子的原位快速检测方法，具体包括以下步骤：将本发明第二方面的表面增强拉曼散射基底上含金纳米颗粒自组装薄膜的一侧与待测溶液的表面贴合接触，而后采用拉曼光谱仪进行检测。非法添加剂分子包括孔雀石绿、罗丹明b、苏丹红、碱性橙中的至少一种；液相体系具体包括但不限于饮料、饮用水、水产养殖水、江河湖泊水。

以上检测方法，采用本发明第二方面的表面增强拉曼散射基底，通过倒置的方式将表面增强拉曼散射基底上含金纳米颗粒自组装薄膜的一侧朝下，与待测溶液的表面贴合接触进行检测，操作简便，可实现液相体系中非法添加剂分子的原位快速检测，不用破坏待检测物或提取待检测物后再滴于表面增强拉曼散射基底上；并且检测灵敏度高，稳定性和重现性好。

以上采用拉曼光谱仪检测待测溶液的拉曼散射信号，具体可通过采用激光从表面增强拉曼散射基底上背离金纳米颗粒自组装薄膜的一侧射入，并调整聚焦深度使激光聚焦在金纳米颗粒自组装薄膜上，而后进行液相体系中非法添加剂分子的原位sers检测，得到sers图，并可根据特征峰进行定性分析。其中，拉曼光谱检测所使用激光的波长一般为532nm、633nm或785nm，扫描范围为200～2000cm^-1。

一般而言，表面增强拉曼散射基底上金纳米颗粒自组装薄膜的层数越多，对sers信号的增强效果越好，但由于以上检测方法中表面增强拉曼散射基底采用倒置的方式进行检测，若金纳米颗粒自组装薄膜的层数过多，则会降低激光和sers信号的透过率。经验发现，以上检测方法采用含两层金纳米颗粒自组装薄膜的表面增强拉曼散射基底进行检测可在保证透过率的同时最大增强sers信号。

本发明的有益技术效果是：本发明提供一种表面增强拉曼散射基底及其制备方法和原位快速检测方法，该制备方法通过向金纳米颗粒溶液中加入溶剂，静置分层；该溶剂与所述金纳米颗粒溶液不互溶，且浮于金纳米颗粒溶液的上方，形成具有液液分界面的分层现象；再将醇类溶液注入金纳米颗粒溶液中，金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒转移至液液分界面，进而通过自组装形成致密的金纳米颗粒自组装薄膜；再将金纳米自组装薄膜转移至透明基底上，制得表面增强拉曼散射基底。由上，在液液分界面通过自组装的方式可形成致密有序的金纳米颗粒排布，将金纳米颗粒自组装薄膜转移至透明基底上形成的表面增强拉曼散射基底，其可用于非法添加剂分子(包括孔雀石绿、罗丹明b、苏丹红、碱性橙等)的检测，检测过程非法添加剂分子一旦进入金纳米颗粒自组装薄膜上的金纳米颗粒之间的间隙(此间隙宽度通常小于10nm，称为“热点”)中，其拉曼散射信号(即sers信号)被强烈增强，灵敏度高；并且金纳米颗粒自组装薄膜上金纳米颗粒的致密整齐排列可使检测到的sers信号均匀度高，稳定性和重现性好。另外，可采用倒置的方式通过将表面增强拉曼散射基底上含金纳米颗粒自组装薄膜的一侧朝下，与待测溶液的表面贴合接触，进行液相体系中非法添加剂分子的快速原位实时检测，不用破坏待检测物或提取待检测物后再滴于表面增强拉曼散射基底上进行检测，操作简便。

说明书附图

为了更清楚的说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单说明。

图1是实施例1中步骤s2所制得金纳米颗粒溶液的金纳米颗粒的透射电子显微镜照片；

图2是实施例1中步骤s3所制得金纳米颗粒自组装薄膜的扫描电子显微镜照片；

图3是对比例1中步骤s3所制得金纳米颗粒聚集体的扫描电子显微镜照片；

图4是采用实施例1表面增强拉曼散射基底对湖水中不同浓度孔雀石绿分子的sers检测光谱图；

图5是采用实施例1表面增强拉曼散射基底对湖水中10^-6m孔雀石绿分子sers检测重现性的光谱图；

图6是采用对比例1表面增强拉曼散射基底对湖水中10^-6m孔雀石绿分子sers检测重现性的光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种表面增强拉曼散射基底，其制备方法包括以下步骤：

s1、将150ml浓度为2.2mm的柠檬酸钠溶液煮沸，快速加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，热回流10min后，停止加热，得到金纳米颗粒种子溶液；

s2、制备金纳米颗粒溶液；具体包括：

①向步骤s1所得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

②将步骤①重复两次，完成第一轮金纳米颗粒的生长，得到含粒径为15～28nm金纳米颗粒的金纳米颗粒溶液；

③取55ml第一轮制得的金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为60mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第二轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

④往步骤③制得金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑤将步骤④重复两次，完成第二轮金纳米颗粒的生长，得到第二轮金纳米颗粒溶液；

⑥取55ml步骤⑤制得的第二轮金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为60mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第三轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

⑦往步骤⑥制得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑧将步骤⑦重复两次，完成第三轮金纳米颗粒的生长，得到第三轮金纳米颗粒溶液。

s3、在血清瓶中加入5ml步骤s2制得的金纳米颗粒溶液，并在其中加入5ml己烷，加入后己烷悬浮于金纳米颗粒溶液的上方，形成具有液液分界面的分层现象；然后将2ml乙醇溶液缓慢注入到金纳米颗粒溶液中，随后金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒转移至液液分界面，并通过自组装形成金纳米颗粒自组装薄膜；

s4、采用lb技术，将步骤s3制得的金纳米颗粒薄膜自组装薄膜转移至柔性透明的pdms基底上，形成pdms支持的金纳米颗粒自组装单层膜，得表面增强拉曼散射基底。

实施例2

一种表面增强拉曼散射基底，其制备方法包括以下步骤：

s1、将150ml浓度为2mm的柠檬酸钠溶液煮沸，快速加入1ml浓度为20mm的氯金酸溶液，热回流15min后，停止加热，得到金纳米颗粒种子溶液；

s2、制备金纳米颗粒溶液；具体包括：

①向步骤s1所得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为20mm的氯金酸溶液，加热30min；

②将步骤①重复两次，完成第一轮金纳米颗粒的生长，得到第一轮金纳米颗粒溶液；

③取55ml步骤②制得的第一轮金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为50mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第二轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

④往步骤③制得金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑤将步骤④重复两次，完成第二轮金纳米颗粒的生长，得到第二轮金纳米颗粒溶液；

⑥取60ml步骤⑤制得的第二轮金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为60mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第三轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

⑦往步骤⑥制得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑧将步骤⑦重复两次，完成第三轮金纳米颗粒的生长，得到第三轮金纳米颗粒溶液。

s3、在血清瓶中加入5ml步骤s2制得的金纳米颗粒溶液，并在其中加入5ml己烷，加入后己烷悬浮于金纳米颗粒溶液的上方，形成具有液液分界面的分层现象；然后将2ml乙醇溶液缓慢注入到金纳米颗粒溶液中，随后金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒转移至液液分界面，并通过自组装形成金纳米颗粒自组装薄膜；采用以上方法制备3片金纳米颗粒自组装薄膜；

s4、采用lb技术，依次将步骤s3制得的3片金纳米颗粒自组装薄膜转移至同一片柔性透明的pmma基底上，使成层叠设置，形成pmma支持的金纳米颗粒自组装三层膜，得到表面增强拉曼散射基底。

实施例3

一种表面增强拉曼散射基底，其制备方法包括以下步骤：

s1、将150ml浓度为2.5mm的柠檬酸钠溶液煮沸，快速加入1ml浓度为30mm的氯金酸溶液，热回流15min后，停止加热，得到金纳米颗粒种子溶液；

s2、制备金纳米颗粒溶液；具体包括：

①向步骤s1所得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为30mm的氯金酸溶液，加热30min；

②将步骤①重复两次，完成第一轮金纳米颗粒的生长，得到第一轮金纳米颗粒溶液；

③取60ml步骤②制得的第一轮金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为50mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第二轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

④往步骤③制得金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为30mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑤将步骤④重复两次，完成第二轮金纳米颗粒的生长，得到金纳米颗粒溶液；

s3、在血清瓶中加入5ml步骤s2制得的金纳米颗粒溶液，并在其中加入5ml己烷，加入后己烷悬浮于金纳米颗粒溶液的上方，形成具有液液分界面的分层现象；然后将2ml乙醇溶液缓慢注入到金纳米颗粒溶液中，随后金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒转移至液液分界面，并通过自组装形成金纳米颗粒自组装薄膜；采用以上方法制备2片金纳米颗粒自组装薄膜；

s4、采用lb技术，依次将步骤s3制得的2片金纳米颗粒自组装薄膜转移至柔性透明的pet基底上，且层叠设置，形成pet支持的金纳米颗粒自组装两层膜，得到表面增强拉曼散射基底。

对比例1

一种表面增强拉曼散射基底，其制备方法包括以下步骤：

s1、将150ml浓度为2.2mm的柠檬酸钠溶液煮沸，快速加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，热回流10min后，停止加热，得到金纳米颗粒种子溶液；

s2、制备金纳米颗粒溶液；具体包括：

①向步骤s1所得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

②将步骤①重复两次，完成第一轮金纳米颗粒的生长，得到含粒径为15～28nm金纳米颗粒的金纳米颗粒溶液；

③取55ml第一轮制得的金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为60mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第二轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

④往步骤③制得金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑤将步骤④重复两次，完成第二轮金纳米颗粒的生长，得到第二轮金纳米颗粒溶液；

⑥取55ml步骤⑤制得的第二轮金纳米颗粒溶液，加入53ml超纯水和2ml浓度为60mm的柠檬酸钠溶液，将此作为第三轮生长的金纳米颗粒种子溶液；

⑦往步骤⑥制得的金纳米颗粒种子溶液中加入1ml浓度为25mm的氯金酸溶液，加热30min；

⑧将步骤⑦重复两次，完成第三轮金纳米颗粒的生长，得到第三轮金纳米颗粒溶液。

s3、吸取步骤s2所制得的金纳米颗粒溶液滴到柔性透明的pdms基底上，待金纳米颗粒溶液干燥后，在pdms基底上形成金纳米颗粒聚集体，得到表面增强拉曼散射基底。

采用透射电子显微镜观察实施例1表面增强拉曼散射基底的制备方法中步骤s2所制得金纳米颗粒溶液的金纳米颗粒，所得结果如图1所示。由图1可知，通过实施例1中步骤s2所制得金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒尺寸均一。

另外，采用扫描电子显微镜检测实施例1中步骤s3所制得金纳米颗粒自组装薄膜和对比例1中步骤s3所制得的金纳米颗粒聚集体，所得结果如图2和图3所示。由图2可知，实施例1中在液液分界面通过自组装的方式形成的金纳米颗粒自组装薄膜中金纳米颗粒致密排列、整齐有序；而由图3可知，对比例1中通过直接吸取溶液滴于基底上再进行干燥的方式设置金纳米颗粒聚集体，金纳米颗粒的排布混乱无序。

以上实施例的表面增强拉曼散射基底可用于非法添加剂分子(孔雀石绿、罗丹明b、苏丹红、碱性橙等)的检测，尤其是液相体系中非法添加剂分子的检测。

例如，可采用实施例1所制得的表面增强拉曼散射基底检测湖水中不同浓度的孔雀石绿分子。具体配置孔雀石绿分子浓度分别为10^-6m(即mol/l)、10^-7m、10^-8m的湖水溶液，而后通过以下方法进行检测：采用实施例1中的表面增强拉曼散射基底，将表面增强拉曼散射基底上含有金纳米颗粒自组装薄膜的一侧朝下，与待测溶液的表面贴合接触，而后通过激光从表面增强拉曼散射基底上背离金纳米颗粒自组装薄膜的一侧射入，并调整聚焦深度使激光聚焦在金纳米颗粒自组装薄膜上，而后进行液相体系中非法添加剂分子的原位sers检测。检测所得结果如图4所示。由图4可知，采用该表面增强拉曼散射基底进行孔雀石绿分子检测，检测下限浓度可达10^-7m，检测灵敏度高。此外，在检测过程中，由于基底密度小于待测溶液，基底会漂浮于溶液表面，但基底表面的金纳米颗粒自组装薄膜浸入溶液中，待测溶液中的部分待检测分子一旦进入金纳米颗粒之间的间隙，其拉曼散信号被显著增强，从而可实现实时原位检测，不用破坏待检测物或提取待检测物后再滴于基底上，操作简便。

另外，分别采用实施例1和对比例1所制得的表面增强拉曼散射基底对湖水中10^-6m孔雀石绿分子进行sers检测，以考察两者对液相中非法添加剂分子的检测稳定性和信号重现性，所得结果如图5和图6所示。其中，采用本发明实施例1表面增强拉曼散射基底对湖水中10^-6m孔雀石绿分子进行sers检测重现性的相对标准偏差为3.2％，采用对比例1表面增强拉曼散射基底对湖水中10^-6m孔雀石绿分子进行sers检测重现性的相对标准偏差为40.8％。图5和图6所示结果证明采用本发明实施例1中通过液液界面自组装和lb转移技术所形成的金纳米颗粒自组装薄膜作为sers基底，比采用对比例1中直接将金颗粒溶液滴于基底上所形成的金纳米颗粒聚集体为sers基底，具有更好的光谱重现性和检测稳定性。

尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所述权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。