纳米粒子聚集体的制作方法

本公开整体涉及纳米粒子聚集体以及以受控方式制备纳米粒子聚集体的方法。所述纳米粒子聚集体可用于包括检测和定量测定在内的多种应用中。在一个示例中，纳米粒子聚集体在医学诊断应用中特别有用。背景技术：：纳米粒子已变得越来越普遍地用于诊断、预后和治疗应用范围中。在此类应用中使用纳米粒子的许多优点来自于粒子的小尺寸(这有助于纳米粒子在流体环境中快速且一致的扩散)、来自于可制成纳米粒子的材料的多样性(这产生特定的电化学特性，诸如荧光、磁性、胶体形成等)以及来自于可与纳米粒子表面稳定缀合的试剂的广泛多样性(从而实现使用与纳米粒子缀合的标记部分、靶向部分、治疗部分等进行广泛应用的可能性)。量子点被认为是一类具有荧光特性的纳米粒子，它们因易于被视觉检测而在标记应用中特别有用。一般而言，量子点是显示出高量子产额、宽吸收光谱、依赖于尺寸的窄光致发光发射光谱以及对光致漂白和化学降解具有高抗性的纳米级半导体材料(参见，例如，koole等人，(2009)nanomedicineandnanotechnologysep-oct；1(5)：475-91)。通过将多个量子点嵌入到支架材料(例如，二氧化硅、聚苯乙烯等)中以保持多个量子点在物理上紧邻，已经产生了相比于单独的单个量子点具有更大信号强度的量子点聚集体。例如，已将多色量子点掺入到聚苯乙烯微珠中，用于高通量遗传筛查应用(han等人，(2001)nat.biotechnol.19：631-635)。在另一个示例中，已将诸如fe3o4的磁性纳米粒子掺入到还包括量子点的纳米粒子构建体中，以允许使用外部磁场将纳米粒子构建体特异性靶向到精确位置(hong等人，(2004)chem.mater.16：4022-4027)。由例如磁性纳米粒子或纳米粒子与特异性结合剂(诸如抗体)的缀合物提供的附加功能已表明，此类纳米粒子在靶向药物递送或靶向医学成像中可能是特别有用的。许多纳米粒子有意地以稳定胶体的形式提供，所述稳定胶体保持单个纳米粒子在整个胶体悬浮液中的大致均匀的分散。纳米粒子在此类悬浮液中的聚集通常是胶体悬浮液受到特定环境影响的不利结果。因此，已经进行了许多工作来产生稳定的纳米粒子胶体悬浮液，所述胶体悬浮液保持单个纳米粒子在整个胶体悬浮液中的大致均匀的分散，即使在环境变化的情况下也是如此。技术实现要素：发明人现在已设计出可控制地产生具有特别有利的物理化学特性的纳米粒子聚集体的方法。这些有利的特性使得纳米粒子聚集体可用于多种应用中，包括(例如)分析方法，诸如诊断方法。本文公开的方法基于在纳米粒子胶体悬浮液中吸引力与排斥力之间存在的微妙平衡的受控失稳，从而导致单个纳米粒子受控聚集成更大的纳米粒子聚集体。通常，由于单个纳米粒子之间的净排斥力，纳米粒子的胶体悬浮液保持在稳定分散状态，所述净排斥力通常是由于溶液中的游离离子在通常涂覆有两亲性材料的单个纳米粒子表面周围局部积累所导致的。本文公开的方法可用于微调支撑胶体悬浮液的条件，以产生用于各种应用的稳定纳米粒子聚集体。本文公开的方法的一个特别的优点是它们可以可靠地产生具有窄尺寸分布的纳米粒子聚集体群，这进一步增加了纳米粒子聚集体在分析或诊断应用中的适用性。本文公开的方法基于dlvo(derjaguin、landau、verwey和overbeek)理论(derjaguin，b.等人，(1941)actaphysicochemicaurss，14：633)，该理论描述了溶液中带电粒子间的吸引力与排斥力之间的关系。虽然静电力通常使此类粒子在中到短距离的距离上彼此排斥，但其他非共价力(例如范德瓦尔斯力)使此类粒子在非常短距离商彼此吸引。为了使单个粒子在溶液中变得彼此稳定地缔合，需要克服由排斥力产生的能量势垒，以使粒子彼此紧密缔合，使得吸引力将粒子拉在一起并保持它们处于稳定缔合状态(图1示出了所涉及的力的示意图)。简而言之，粒子之间的距离决定了相互作用是吸引还是排斥。当两个粒子分开大的距离时，它们不能彼此感知，并且净相互作用能量接近零。当粒子处于中到短距离时(例如，在稳定胶体的情况下)，静电排斥成为主导。在非常短的距离处，一系列非共价吸引相互作用(例如范德瓦尔斯力)成为主导。因此，如果接近的粒子要聚集，则它们需要具有足够的能量(例如热能)来越过所产生的能量势垒。静电排斥越强，粒于发生碰撞和聚集的可能性就越小。在稳定胶体中，热能不足以使粒子越过能量势垒，因此，单个粒子继续相互排斥。本文公开的方法包括可控地降低溶液中粒子之间的能量势垒，以使粒子足够靠近在一起，使得粒子之间的吸引性静电力将这些粒子保持在一起，从而形成聚集体。因此，在一个方面，本公开提供了用于诱导包含两亲性涂层的纳米粒子的受控聚集的方法，所述方法包括使多个所述纳米粒子与包含有机溶剂的离子溶液接触。本文公开的方法可包括可控地降低溶液中具有相同表面电荷的粒子之间的能量势垒，使得粒子之间的静电排斥力可被克服。因此，所述方法可包括增加当溶液中的两个粒子彼此接近时产生净静电吸引力的可能性。因此，所述方法可包括以受控方式主动改变使溶液中的粒子分开的排斥力。对调控粒子在溶液中的分散的静电力的这种改变和/或控制(例如，如dlvo理论中所述)可通过例如至少部分地移除溶液中的单个纳米粒子上的两亲性涂层(例如，通过使用有机溶剂)来实现。这可减少单个纳米粒子上的表面电荷，并因此可减小单个纳米粒子之间的排斥力。部分移除两亲性涂层还可使单个纳米粒子的下面的疏水性表面暴露。暴露的疏水表面在水性环境中通常是不稳定的，并且与范德瓦尔斯吸引力一起有助于粒子在碰撞后以聚集体的形式保持在一起。类似地，在本文公开的方法中使用离子溶液也可减少单个纳米粒子上的表面电荷，因此可减小单个纳米粒子之间的排斥力。在这两种情况下，粒子之间的能量势垒均可被降低，使得碰撞后单个纳米粒子之间存在净吸引力，从而导致形成纳米粒子聚集体。在本文公开的方法中可使任何可以影响dlvo理论的一个或多个参数(包括范德瓦尔斯力、平均场近似、表面电势、热能、粒子的表面半径、流体介电常数、离子浓度、bjerrum长度和debye-hückel长度)的实验变量以任何组合变化，以控制纳米粒子的聚集速率。因此，本文公开的方法可包括改变影响dlvo理论的一个或多个参数的任何一个或多个实验条件以控制纳米粒子的聚集，所述一个或多个参数选自由范德瓦尔斯力、平均场近似、纳米粒子表面电势、热能、纳米粒子表面半径、流体介电常数、离子浓度、bjerrum长度和debye-hückel长度组成的组。本文描述了变量的示例，所述变量可被改变以便通过改变溶液中粒子之间的吸引力和/或排斥力和/或能量势垒控制纳米粒子聚集体的形成。聚集速率和通过所述方法产生的纳米粒子聚集体的尺寸可根据需要通过改变多个实验条件中的任一者或多者来控制。例如，可改变离子溶液的摩尔浓度以控制纳米粒子的聚集速率。例如，可增加离子溶液的摩尔浓度以增加纳米粒子的聚集速率。替代地或另外地，可改变有机溶剂的量以控制纳米粒子的聚集速率。例如，可增加有机溶剂的量以增加纳米粒子的聚集速率。替代地或另外地，可改变所使用的有机溶剂以控制纳米粒子的聚集速率。例如，可使用更强的有机溶剂以增加纳米粒子的聚集速率。替代地或另外地，可改变单个纳米粒子上的表面电荷以控制纳米粒子的聚集速率。例如，可减少单个纳米粒子上的表面电荷以增加纳米粒子的聚集速率。在一个示例中，单个纳米粒子的初始表面电荷可在约-60mv至约+40mv的范围内。在另一个示例中，单个纳米粒子的初始表面电荷可在约-30mv至约0mv的范围内。替代地或另外地，可改变在其中进行聚集的反应混合物的温度以控制纳米粒子的聚集速率。例如，可增加在其中进行聚集的反应混合物的温度以增加纳米粒子的聚集速率。应当理解，在本文公开的任何方法中可使上述因素(包括离子溶液的摩尔浓度、有机溶剂的量、所使用的特定有机溶剂(即，所使用的有机溶剂的强度)、单个纳米粒子上的表面电荷以及进行聚集时的温度)中的任一者或多者以任何组合或排列变化。可改变这些因素以实现期望的聚集速率，从而产生具有期望物理化学特性的纳米粒子聚集体。这些因素中的任一者或多者的变化可在聚集过程本身中进行，或者可通过在进行所述方法之前预先选择具体的实验条件或组分来实现。因此，本文公开的任何方法可包括监测聚集过程并改变上述因素(包括离子溶液的摩尔浓度、有机溶剂的量、所用的特定有机溶剂(即，所使用的有机溶剂的强度)、单个纳米粒子的表面电荷以及进行聚集时的温度)中的任一者或多者，以确保产生期望的聚集体。因此，本文公开的任何方法可包括实时监测聚集体的生长。这种变化还可包括进行一系列其中这些可变因素中的一者或多者不同的实验、分析每个实验的结果以及选择用于本文公开的方法的最佳值。因此，这种变化可作为迭代过程进行，从而针对每个具体的期望结果优化可变因素中的一者或多者。在本文公开的任何方法中，纳米粒子可以是荧光纳米粒子和/或磁性纳米粒子。优选地，纳米粒子是荧光纳米粒子。在本文公开的任何方法中，纳米粒子可包含量子点或由量子点组成。在本文公开的任何方法中，纳米粒子可包含在两亲性涂层下面的疏水层。本文公开的任何方法还可包括分离纳米粒子聚集体的步骤。可使用任何合适的方法分离纳米粒子聚集体。在一个示例中，分离步骤包括离心。可进行离心使得期望尺寸的纳米粒子聚集体在离心容器的底部形成沉淀，而还未聚集的单个纳米粒子或过小的纳米粒子聚集体保留在上清液中。可将包含纳米粒子聚集体的沉淀与上清液和纳米粒子分离，并将其重悬在任何期望的溶液中。其他合适的分离方法包括例如过滤和/或沉积。本文公开的任何方法还可包括一个或多个下游处理步骤，以使纳米粒子聚集体适用于其预期用途。因此，本文公开的任何方法还可包括以下步骤：分离纳米粒子聚集体；稳定纳米粒子聚集体(例如，通过将稳定剂施加到纳米粒子聚集体的表面)；对纳米粒子聚集体涂底漆以进一步功能化(例如，通过将一种或多种反应性物质施加到聚集体的表面)；使纳米粒子聚集体功能化(例如，通过将纳米粒子聚集体与一个或多个功能部分缀合)；以及调配纳米粒子聚集体以用于其预期用途(例如，通过将纳米粒子聚集体悬浮在稳定缓冲液(诸如药学上可接受的缓冲液)中，或通过将纳米粒子聚集体沉积在测定材料的表面中或表面上)，将纳米粒子聚集体储存在容器中；或任何其他下游处理步骤。应当理解，本文公开的方法可包括以任何组合或排列的方式进行这些下游处理步骤中的任一者或多者。本文公开的方法的一个优点是不需要额外的支架材料来使纳米粒子聚集以及使纳米粒子保持为聚集形式。先前已知的纳米粒子聚集体通常包含其中嵌入了多个纳米粒子的支架材料(例如二氧化硅、聚苯乙烯等)。由于支架材料的干扰，这些嵌入的纳米粒子的作用通常被减弱。相比之下，本公开允许在不存在支架材料(诸如二氧化硅、聚苯乙烯等)的情况下形成稳定的纳米粒子聚集体。因此，避免了由支架材料引起的任何对纳米粒子特性的潜在干扰。例如，当用于制备聚集体的纳米粒子是荧光时(例如，当纳米粒子是量子点时)，由聚集形式的纳米粒子发射的荧光信号不会因支架材料的存在而被减弱。相反，由本文公开的方法产生的聚集的荧光纳米粒子(例如，聚集的量子点)所发射的信号显著放大(因为整个聚集体体积的绝大部分有助于信号产生)，从而导致在检测应用中有显著优点。因此，本文公开的任何方法可排除支架材料的使用。本文公开的方法允许产生基本上由聚集的单个纳米粒子组成的纳米粒子聚集体。聚集的纳米粒子通常通过非共价结合力保持在一起。本文公开的方法带来的另一个优点是它们诱导纳米粒子的自聚集，当这些聚集体重悬于溶液中时这些纳米粒子保持稳定聚集。不需要进行昂贵或复杂的缀合步骤来产生纳米粒子聚集体。相反，可简单地在单个容器中以单个步骤组合反应组分，从而导致通过自组装而形成期望的聚集体。聚集过程可通过多种简单的方式在任何时间处停止，包括通过向反应混合物中添加水，通过物理方式将聚集体与反应混合物分离(例如，通过离心和/或过滤和/或沉积)，通过改变反应混合物的温度(例如，通过将反应混合物冷却至低于20℃，诸如低于15℃、诸如低于10℃、诸如低于5℃、诸如低于1℃、诸如约10℃、诸如约5℃，例如约4℃等)或通过任何其他合适的方式。本文公开的纳米粒子聚集体产生的容易性降低了生产过程的成本和复杂性，这与在支架材料中聚集纳米粒子或通过缀合化学以将单个纳米粒子彼此化学连接的替代方法相比提供了显著的优点。因此，本文公开的方法可作为一步聚集方法来进行。本文公开的方法可排除将单个纳米粒子彼此共价结合以形成聚集体的步骤。本公开还提供了通过本文公开的方法中的任一种形成的纳米粒子聚集体。本公开还提供了包含多个纳米粒子的稳定纳米粒子聚集体。纳米粒子聚集体可包含本文在本文公开的方法的上下文中描述的任何特征。因此，例如，纳米粒子聚集体可包含多个纳米粒子，其中这些纳米粒子是荧光纳米粒子和/或量子点。还可使纳米粒子聚集体稳定(例如，聚集体可包含稳定剂的外层，诸如蛋白质层或抗体层，其中的任一者可共价或非共价结合到纳米粒子聚集体的表面上)。另外或替代地，纳米粒子聚集体可被功能化。例如，纳米粒子聚集体可包含共价结合的功能部分。该功能部分可以是本文所述的任何功能部分。因此，例如，功能部分可以是如本文所述的捕获试剂。在一个示例中，捕获试剂可以是抗体。本公开还提供了如本文所公开的多个纳米粒子聚集体。这些聚集体可具有均匀的尺寸分布。这些聚集体可提供在容器中，使得它们可用于制造测试试剂盒，诸如诊断测试试剂盒。这些聚集体可以任何合适的形式提供，诸如以溶液的形式，诸如以冻干的形式，诸如粉末。另外，本公开提供了一种测定试剂盒，其包含通过本文公开的方法中的任一种形成的纳米粒子聚集体。在一个示例中，测定试剂盒可包含侧向流测定试剂盒。本公开还提供了一种生产测定试剂盒的方法，所述方法包括将通过本文公开的方法中的任一种形成的纳米粒子聚集体沉积到测定试剂盒的至少一部分的表面中或表面上。在一个示例中，所述方法包括生产侧向流测定试剂盒，包括将通过本文公开的方法中的任一种形成的纳米粒子聚集体沉积到侧向流材料的表面上。沉积的纳米粒子聚集体可以是可移动的，并且可与特异性结合目标分析物的捕获试剂缀合。当潜在地包含目标分析物的样品被添加到侧向流测定试剂盒中时，纳米粒子聚集体可与样品中存在的任何目标分析物特异性结合，从而允许通过检测纳米粒子聚集体来检测和/或定量目标分析物。如上所述，荧光纳米粒子聚集体(诸如量子点聚集体)特别适用于此类测定试剂盒。本公开还提供了通过本文公开的方法中的任一种形成的纳米粒子聚集体在制造用于检测样品中的分析物的存在的诊断测定装置中的用途。本公开还提供了检测样品中的分析物的方法，所述方法包括使样品与如本文所公开(例如，根据本文公开的方法中的任一种生产)的纳米粒子聚集体接触，其中该纳米粒子聚集体与特异性结合分析物的捕获试剂缀合，并且其中所述方法包括检测与分析物结合的任何纳米粒子聚集体。附图说明现在参考附图以示例的方式描述本公开的实施方案，其中：图1示出了当两个胶体粒子彼此紧密接近时的主要相互作用的示意图。图2示出了在使qdot与溶剂混合物(4∶1的甲醇∶1，2丙二醇溶液中的5％四氢呋喃(thf))接触后形成的纳米粒子聚集的透射电子显微镜(tem)图像。图3示出了溶剂混合物的摩尔浓度对纳米粒子聚集的影响。图4示出了对于三种不同的反应混合物摩尔浓度(10.7mm、10.6mm和10.5mm)的以下项的荧光强度(y轴)：qdot胶体悬浮液(qd原液；第一条柱)，相比于上清液(第二条柱)、第一次温育期后的纳米粒子聚集体(第1次温育后的粒子；第三条柱)以及总温育期完成后的纳米粒子聚集体(最终粒子；最后一个条柱)。图5示出了不同批次的可商购获得的qdot的荧光强度(y轴)，比较了初始qdot胶体悬浮液(输入；第一条柱)与上清液(第二条柱)和温育期后的纳米粒子聚集体(样品；最后一个条柱)相比的强度。图6示出了使用izon分析的实时纳米粒子聚集体的生长情况。主图示出了纳米粒子聚集体群在240分钟的时间段内逐渐增加。插图示出了作为时间函数的粒子浓度。在生长过程期间达到临界尺寸后，由于较大的聚集体合并在一起，粒子浓度开始下降。图7示出了每个纳米粒子聚集体中fitc-缀合mab的数量的估计。图8示出了在两种代表性流感病毒样品(flua和flub)的检测中，来自使用功能化纳米粒子聚集体与使用功能化的包封qdot进行的相同检测相比的数据。本文公开的纳米粒子聚集体观察到更大的幅度峰。图9示出了在聚集期间的四个不同时间点处在三个不同批次的量子点中离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度(qd原液＝第一条柱；t0＝第二条柱；t1h＝第三条柱；t1.5h＝第四条柱；t2h＝第五条柱；t2.5h＝第六条柱(仅出现在批次1810794中))。纳米粒子聚集体(例如，批次1730907)的更快生长对应于上清液中残余荧光的更快降低。图10示出了在聚集期间的四个不同时间点处三个不同批次的量子点的平均纳米粒子聚集体尺寸(直径)，如使用动态光散射所确定的(t1h＝第一条柱；t1.5h＝第二条柱；t2h＝第三条柱；t2.5h＝第四条柱(仅出现在批次1810794中))。图11示出了在聚集期间的六个不同时间点处，对于包含三种不同浓度的氯化钠的反应混合物中的ocean羧基qdot，离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度。示出了与对照qdot(thermofisher的dq800)的比较(原液＝第一条柱；t0＝第二条柱；t0.5＝第三条柱；t1＝第四条柱；t1.5＝第五条柱；t2＝第六条柱；y2.5＝第七条柱(仅出现在qd800中))。图12示出了在不同的thf浓度下(2.5％thf＝第一条柱；3％thf＝第二条柱；3.5％thf＝第三条柱)对于peg-oh和-nh2qdot，离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度。图13示出了在包含thf、dmf或吡咯烷的反应混合物中(thf＝第一条柱；dmf＝第二条柱；吡咯烷＝第三条柱)在qdot聚集期间的四个不同时间点处离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度。图14示出了在聚集过程中的不同时间点处使用dls测量的平均纳米粒子聚集体尺寸。图15示出了功能化纳米粒子聚集体(多qdot微粒；左图，深灰色)相比于单个qdot纳米粒子(右图，浅灰色)在各自不同浓度下的比较。图16示出了纳米粒子聚集体(多qdot微粒；左图，浅灰色)和单个qdot纳米粒子(右图，黑色)在使用侧向流测定检测流感抗原中的应用。示出了在不同抗原浓度下产生的信号。图17示出了在室温(第一条柱)、30℃(第二条柱)或37℃(第三条柱)下进行的聚集过程中，在qdot聚集期间的不同时间点处离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度。图18示出了在包含thf(第一条柱)、dmf(第二条柱)或吡咯烷(第三条柱)的反应混合物中进行的聚集过程中，在qdot聚集期间的不同时间点处离心移除纳米粒子聚集体后上清液中的残余荧光强度。具体实施方式概述在本说明书通篇中，除非另外明确规定或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应当被视为涵盖一个(种)和多个(种)(即，一个(种)或多个(种))那些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组。本领域技术人员将理解，除了具体描述的内容之外，本文所描述的公开内容易于进行变化和修改。应当理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还单独地或共同地包括在本说明书中提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何和所有组合或任何两者或更多者。本公开不限于本文所述具体示例的范围，这些具体示例仅旨在用于举例说明的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围之内。术语“和/或”，例如“x和/或y”应当理解为表示“x和y”或者“x或y”，并且应当被视为对这两种含义或对任一种含义提供明确的支持。如本文所用，术语“约”是指指定值的+/-10％的范围。为避免疑问，术语“约”也被视为对随后的确切数字提供明确的支持(例如，术语“约10”被视为对10本身提供明确的支持)。在整篇本说明书中，词语“包括”或变型形式诸如“包含”或“具有”将被理解为意味着包含所指出的要素、整数或步骤，或者要素组、整数组或步骤组，但并不排除任何其他的要素、整数或步骤，或者要素组、整数组或步骤组。如本文所用，当关于两个实体使用时，术语“缀合”、“缔合”、“连接”、“结合”、“附接”、“系留”、“吸附”及其等同物是指这些实体直接或经由一个或多个充当连接剂的另外的实体彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得这些实体在使用该结构的条件下(例如测定条件或生理条件下)保持物理缔合。在一些示例中，这些实体可通过一个或多个共价键彼此附接。在一些示例中，这些实体可通过涉及特定(但非共价)结合(例如，链霉亲和素/抗生物素蛋白相互作用、抗体/抗原相互作用、核苷酸/核苷酸相互作用等)的机制彼此附接。在一些示例中，这些实体可通过非共价、非特异性键(例如，范德瓦尔斯力)彼此附接。在一些示例中，两个实体可由于一个实体被物理吸附到另一实体的表面上或由于静电力而被缀合在一起。在一些示例中，足够数量的较弱的交互作用可为两个实体保持物理缔合提供足够的稳定性。应当理解，本文公开的纳米粒子聚集体通常通过单个纳米粒子之间的非共价力保持在一起。相比之下，本文公开的与纳米粒子聚集体缀合的功能部分的许多示例涉及一种或多种共价相互作用。如本文所用，术语“诊断”及其变体诸如“诊断的”、“被诊断”或“进行诊断”包括任何临床状态的初步诊断或复发性疾病的诊断。本文提及的“样品”应被理解为是指源自动物或环境来源的任何样品。样品可以是生物样品。生物样品可以是例如从受试者获得或以其他方式衍生的任何材料、生物流体、组织或细胞，包括但不限于血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆或血清)、痰液、粘液、鼻吸出物、尿液、精液、唾液、脑膜液、淋巴液、乳、支气管吸出物、细胞提取物、脑组织或脑脊液。样品可包括任何前述的实验分离的级分。例如，血液样品可被分为血清或含有特定类型血细胞(诸如红细胞或白细胞)的级分。如果需要，样品可以是来自个体的样品的组合，诸如组织和流体样品的组合。生物样品还可包括含有均化的固体材料的材料，诸如来自粪便样品、组织样品或组织活检样品；或衍生自组织培养物或细胞培养物的材料。因此，术语“样品”包括样品的提取物和/或衍生物和/或级分。如本文所用，术语“受试者”应被视为意指包括人在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人、灵长类动物、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、捕获的野生动物(例如狐狸、鹿)。例如，哺乳动物可以是人或灵长类动物。在具体示例中，哺乳动物是人。所选择的定义如本文所用，术语“纳米粒子”或其变型诸如“纳米缀合物”旨在表示其尺寸以纳米尺度测量的粒子。例如，术语“纳米粒子”是指直径小于1000纳米(nm)的任何粒子。典型地，纳米粒子的最长直线尺寸(例如，直径)为100nm或更小。纳米粒子的直径可为50nm或更小。例如，纳米粒子的直径可为40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小、10nm或更小或5nm或更小。因此，纳米粒子的直径范围可在1nm-50nm、5nm-30nm、10nm-25nm、10nm-20nm或15nm-20nm范围内。本文公开的纳米粒子的平均直径可为约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约15nm、约10nm或约5nm。在一示例中，本文公开的纳米粒子的平均直径为约25nm或约10nm。本文公开的纳米粒子可形成为任何已知的形状。例如，纳米粒子可以是纳米球、纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米板或任何其他形状。例如，纳米粒子可形成为金字塔形、三角形、分形或任何其他形状。优选地，纳米粒子是纳米球。纳米粒子可以是光学或磁性可检测的。例如，可使用的可检测纳米粒子包括固有荧光或发光纳米粒子、包含荧光或发光部分的纳米粒子、等离子体共振纳米粒子和磁性纳米粒子。本文公开的纳米粒子可包含中心核。核可具有本文公开的任何纳米粒子的尺寸。核材料可包含任何合适的固体材料或由其组成。例如，核材料可包含合成或天然存在的聚合物或由其组成。例如，核可包含硅石(二氧化硅)。替代地，核材料可包含金属或金属混合物或由其组成。金属可以是例如金、银、铁、钴、锌、镉、镍、钆、铬、铜、锰、钯、锡、铝、其合金和/或氧化物，或任何其他金属。金属可以是任何等离子体活性金属或金属的混合物。在一示例中，金属是金、银或二氧化钛。在一具体示例中，金属是银。纳米粒子中金属核的存在可增加纳米粒子聚集体的发射强度(例如，通过被称为“金属增强荧光”的现象)。每个单个纳米粒子的核可被一个或多个壳包围。例如，核可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个壳包围。所述一个或多个壳可包含金属或金属氧化物。例如，壳可以是氧化物，其可包含至少一种选自由ti、fe、cu、zn、y、zr、nb、mo、in、si、sn、sb、ta、w、pb、bi和ce组成的组并且具有2-6的化合价的金属。此类金属的氧化物的形式可以是例如sio2、tio2、fe2o3、cuo、zno、y2o3、zro2、nb2o5、moo3、in2o3、sno2、sb2o5、ta2o5、wo3、pbo或bi2o3。本文公开的纳米粒子可涂覆有有助于纳米粒子的胶体稳定性的两亲性材料。例如，纳米粒子可涂覆有有机层(例如油酸)，该有机层本身涂覆有两亲性层以促进在水性溶剂中的溶解度。两亲性涂层的外层通常增强胶体稳定性，引入亲水层和表面电荷两者使其延伸到水性环境中，从而静电排斥其他纳米粒子，防止絮凝。在两亲性涂层下面，纳米粒子可包含疏水表面。在本文公开的方法中所使用的纳米粒子上可存在任何合适的两亲性涂层。两亲性材料可包括增强多种单个纳米粒子悬浮液的胶体稳定性的任何材料。例如，两亲性涂层可包含zhang等人，(2011)sensors11，11036-11055中描述的任何化合物或化合物的组合。因此，与其中亲水性配体完全替代疏水性配体的直接配体交换过程不同，用两亲性材料包封纳米粒子的方法可使用天然非极性分子作为结合中间体。两亲性材料的疏水部分可插入疏水稳定剂(诸如topo)，而亲水部分可传达水溶性。两亲性材料可包含一种或多种表面活性剂。可使用诸如磷脂(smith，a.m.等人，phys.chem.chem.phys.(2006)8，3895-3903；dubertret，b.science(2002)298，1759-1762；fan，h.等人，nanolett.(2005)5，645-648)、α-环糊精(lala，n.等人，langmuir(2001)17，3766-3768；wang，y.等人，nanolett.(2003)3，1555-1559)、n-链烷酸(shen，l.等人，langmuir(1999)15，447-453)和十六烷基三甲基溴化铵(swami，a.等人，langmuir(2003)19，1168-1172)的表面活性剂。表面活性剂的这些具体示例都已全部用于将纳米粒子转移到水中。然而，由于疏水相互作用相对较弱，它们在经受生物条件时可能不够稳定(yu，w.w.等人，j.am.chem.soc.(2007)129，2871-2879)。使用两亲性聚合物可克服该潜在问题，因为单个聚合物链可拥有多个疏水亚单元，这极大地增强了与纳米粒子表面上的疏水性配体的插入亲和力。因此，两亲性材料可包含一种或多种两亲性聚合物。合适的两亲性聚合物的一个示例描述于yu等人(2007)：两亲性聚合物聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(pmao)-peg。因此，两亲性材料可包含聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(pmao)-peg。制备pmao-peg的方法描述于yu等人(2007)。两亲性聚合物涂覆的纳米粒子的稳定性可通过使最外层共价交联而进一步改善(pellegrino，t.等人，nanolett.(2004)4，703-707；wu，x.等人，nat.biotech.(2003)21，41-46)。因此，本文公开的两亲性材料可包含交联的外层。如本文所用，术语“纳米粒子聚集体”或其任何变体旨在表示彼此紧密接近的多个单个纳米粒子的稳定组装。通常，单个纳米粒子通过非共价相互作用(例如，通过除共价键以外的吸引力)保持在一起。纳米粒子聚集体可包含超过一个的任何数量的单个纳米粒子，这取决于聚集体的期望特性(例如，尺寸、荧光强度等)。通常，纳米粒子聚集体包含超过约10个单个纳米粒子，诸如超过约20个单个纳米粒子、诸如超过约30个单个纳米粒子、诸如超过约40个单个纳米粒子、诸如超过约50个单个纳米粒子、诸如超过约100个单个纳米粒子、诸如超过约150个单个纳米粒子、诸如超过约200个单个纳米粒子、诸如超过约250个单个纳米粒子、诸如超过约300个单个纳米粒子、诸如超过约400个单个纳米粒子、诸如超过约500个单个纳米粒子、诸如超过约600个单个纳米粒子、诸如超过约700个单个纳米粒子、诸如超过约800个单个纳米粒子、诸如超过约900个单个纳米粒子、诸如超过约1,000个单个纳米粒子、诸如超过约1200个单个纳米粒子。优选地，纳米粒子聚集体包含超过约50个单个纳米粒子。可根据聚集体的预期用途来调整聚集体中纳米粒子的数量。例如，聚集体可包含约50、或约100、或约150、或约200、或约250、或约300、或约350、或约400个纳米粒子。在预期将聚集体用于侧向流诊断测定的一个优选实施方案中，聚集体包含约200个纳米粒子。纳米粒子聚集体可以是大于单个纳米粒子尺寸的任何尺寸。通常，纳米粒子聚集体的平均直径为约50nm、或约55nm、或约60nm、或约65nm、或约70nm、或约75nm、或约80nm、或约85nm、或约90nm、或约95nm、或约100nm、或约150nm、或约200nm、或约250nm、或约300nm、或约350nm、或约400nm。例如，纳米粒子聚集体的直径可为约50nm至约400nm，诸如约75nm至约300nm、诸如约100nm至约250nm、诸如约150nm至约200nm。替代地，纳米粒子聚集体的直径可在约50nm至约150nm、诸如约60nm至约120nm、或诸如约75nm至约150nm、或诸如约75nm至约100nm、或诸如约60nm至约90nm的范围内。纳米粒子可以是量子点。如本文所用，术语“量子点”及其变体诸如“qdot”、“qd”等是指具有尺寸依赖性的光致发光特性的半导体纳米晶体。量子点为纳米粒子尺寸。因此，量子点可具有与本文所定义的纳米粒子相同的尺寸。通常，量子点的平均直径可在2nm至20nm的范围内。例如，量子点的平均直径可为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm。本领域已知的任何量子点均可用于本文公开的方法中。例如，量子点可包含任何半导体材料，包括但不限于ii-vi族金属的那些。因此，量子点可包含ii-vi族金属或其合金或混合物。例如，量子点可包含zns、znse、znte、cds、cdse、cdte、hgs、hgse、hgte、mgs、mgse、mgte、cas、case、cate、srs、srse、srte、bas、base、bate等中的任一者或多者。另外，量子点可包含iii-v族金属或其合金或混合物。例如，量子点可包含gan、gap、gaas、gasb、inn、inp、inas、insb等中的任一者或多者。另外，量子点可包含iv族金属或其合金或混合物。例如，量子点可包含ge、si等中的任一者或多者。在一个示例中，量子点包含二元合金，诸如碲化镉、硒化镉、硫化镉、砷化铟和磷化铟。在另一个示例中，量子点包含三元合金，诸如硫硒化镉。在一个具体示例中，量子点包含碲化镉。在另一具体示例中，量子点包含硒化镉。如本领域技术人员将理解的，量子点组成的选择以及量子点的尺寸影响量子点的特征光谱发射波长。可根据需要来选择本文所使用的量子点的材料组成和大小。受控聚集本文公开的方法基于保持稳定胶体悬浮液的静电力的受控破坏。由于单个纳米粒子之间的净排斥力，纳米粒子(包括例如量子点)在分散于悬浮液中时通常形成稳定的胶体。在纳米级主要涉及两种类型的相互作用：熵力(例如静电力)和范德瓦尔斯力(如图1所示)。范德瓦尔斯力是永久/诱导偶极之间的分子间非共价、非静电力，并且当粒子非常接近时是吸引性的。相比之下，熵力通常驱使单个纳米粒子分散在水溶液中。取决于普遍的相互作用，系统可表现出胶体稳定性或不受控的聚集(絮凝)。当纳米粒子分散在水溶液中时，纳米粒子表面上的分子结构限定表面电荷。例如，羧基基团在中性ph下被去质子化，从而产生净负电荷：来自溶液的离子被吸引到带电的纳米粒子表面并形成静电扩散层以屏蔽电荷。因此，当两个相同的粒子紧密接近时，围绕粒子的离子层之间的相互作用导致防止聚集的排斥力。范德瓦尔斯力与这种排斥力相反。通过由能量最大值分开的在范德瓦尔斯力占主导的短距离处的初级势阱以及在较大距离处的次级势阱来表征累积势能。如果能量最大值远大于可用的热能，则絮凝速率非常慢，并且粒子可在溶液中长时间保持稳定(胶体稳定性)。本文公开的方法涉及对这些吸引力和排斥力的精细操纵，以触发单个纳米粒子的聚集。不希望受理论的束缚，发明人认为有机溶剂的存在使单个纳米粒子表面上的两亲性涂层降解，从而降低纳米粒子之间的净排斥力并触发聚集。因此，纳米粒子的初始表面电荷(即，与包含有机溶剂的离子溶液接触之前的表面电荷)减少。本文公开的方法中可使用任何有机溶剂。有机溶剂可包含例如极性质子溶剂或非质子溶剂，或者极性质子溶剂和非质子溶剂的混合物。在一个实施方案中，质子溶剂包含一个或多个羟基(-oh)功能团，并且可包括水。质子溶剂可以是醇。所述醇可以是脂族、脂环族、芳族或杂环的。在一个实施方案中，所述醇是脂族的。质子溶剂的示例包括：乙酸、甲酸、甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇(异丙醇)、丁-1-醇、丁-2-醇(仲丁醇)、2-甲基丙-1-醇(异丁醇)、2-甲基丙-2-醇(叔丁醇)、乙-1，2-二醇、丙-1，2-二醇、丙-1，2，3-三醇、水或其混合物。非质子溶剂可以是烃、卤代烃、杂环化合物、醚或其混合物。非质子溶剂的示例包括：亚甲基氯(二氯甲烷)、1，2-二氯乙烷(氯化乙烯)、三氯甲烷(氯仿)、戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、甲苯、四氢呋喃(thf)、n-甲基吡咯烷酮、乙醚、双甲氧基甲基醚、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈(mecn)、二甲亚砜(dmso)、1，4-二噁烷或其混合物。有机溶剂可包括，例如甲醇、乙醇、丙-2-醇、丁-2-醇、乙-1，2-二醇、丙-1，2-二醇、丙-1，2，3-三醇、三氯甲烷(氯仿)、四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺或1，2-二氯乙烷中的任一者或多者。在一具体示例中，有机溶剂包括四氢呋喃。在一个示例中，有机溶剂包括极性质子溶剂(优选甲醇、丙-1，2-二醇)和非质子溶剂(优选四氢呋喃)的混合物或由其组成。更优选地，有机溶剂还包括四氢呋喃(thf)。包括在溶剂混合物中的thf的精确量可变化，但优选地以1-20％、诸如1-10％、诸如1-5％、或诸如3-20％、诸如3-10％、诸如3-5％、或诸如5-20％、诸如5-10％的范围存在。在一个优选的实施方案中，thf以溶剂混合物的3-5％的范围存在。重要的是，发明人已证实，本文公开的方法中使用的具体溶剂组分可变化，同时仍允许纳米粒子的受控聚集。具体地，可使用更强的有机溶剂以增加纳米粒子的聚集速率。相反，可使用更弱的有机溶剂以降低纳米粒子的聚集速率。为了控制纳米粒子的聚集速率可改变的另一个因素是在本文公开的方法中使用的纳米粒子的表面电荷。因此，本文公开的方法可包括选择具有在-60mv至+60mv范围内的初始表面电荷的纳米粒子。优选地，使用具有负的初始表面电荷的纳米粒子。例如，可使用具有在-30mv至0mv范围内的负的初始表面电荷的纳米粒子。通常，纳米粒子的初始表面电荷越强，聚集将发生得越快。因此，本文公开的方法可包括选择具有更强初始表面电荷的纳米粒子以增加聚集体的形成速率。相反，本文公开的方法可包括选择具有更弱初始表面电荷的纳米粒子以降低聚集体的形成速率。应当理解，可通过选择用于本文公开的方法的合适的纳米粒子，或者通过在纳米粒子与包含有机溶剂的离子溶液接触之前对其进行化学修饰以获得期望的表面电荷，来产生期望的初始表面电荷。为了控制纳米粒子的聚集速率，可改变的另一个因素是所使用的水溶液的摩尔浓度。可例如通过向水溶液中添加一种或多种盐来改变摩尔浓度。合适的盐包括例如：碳酸盐、氯化物盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、乙酸盐、硼酸盐或磷酸盐。因此，可添加的合适的盐包括例如氯化物盐、磷酸盐或硼酸盐。也可使用可商购获得的缓冲液，诸如基础缓冲液(casno.77-86-1；nh2c(ch2oh)3)。在一个优选的实施方案中，盐溶液的摩尔浓度为约10-11mm，诸如约10.5-10.7mm。可提供在这些优选摩尔浓度范围内的任何盐溶液，但在一个优选的实施方案中，盐是具有约10-11mm、诸如约10.5-10.7mm的摩尔浓度的硼酸盐溶液。为了控制纳米粒子的聚集速率可改变的另一个因素是进行聚集的温度。通常，温度越高，聚集发生得越快。相反，温度越低，聚集发生得越慢。可选择任何合适的温度。在一个示例中，本文公开的方法在10℃至50℃、诸如15℃至45℃、诸如20℃至40℃、诸如25℃至35℃的温度范围内进行。本文公开的方法可在约室温、或约30℃、或约37℃的温度下进行。应当理解，温度可在整个聚集过程中保持恒定。替代地，温度可在整个聚集过程中连续变化。替代地，可在聚集过程期间中将温度从第一温度转变到第二温度(并且任选地，进一步转变到一个或多个额外的温度)。这种灵活性增加了可应用于聚集过程的控制水平，以便实现期望的纳米粒子聚集体的产生。为了控制纳米粒子的聚集速率可改变的另一个因素是反应时间。因此，可将反应混合物(包含诱导聚集所需的所有组分)温育足以允许产生具有期望尺寸的纳米粒子聚集体的时间段。同样，可改变反应时间以确保产生具有期望特性的纳米粒子聚集体。例如，可在给定的时间点停止聚集过程，以确保纳米粒子聚集体不会生长至超过阈值尺寸。下游处理在产生期望的纳米粒子聚集体之后，可进行许多任选的下游处理步骤。例如，可通过任何合适的方式(例如，通过离心)分离纳米粒子聚集体。替代地或另外地，可使用本领域为此目的使用的任何合适的稳定手段来进一步稳定纳米粒子聚集体。例如，可将稳定剂(诸如聚合物刷层)施加到聚集体的表面。替代地或另外地，可对纳米粒子聚集体涂底漆以使其进一步与功能剂缀合。该涂底漆可包括向聚集体表面添加另外的涂层，所述涂层包含可促进与功能剂缀合的一个或多个化学部分。替代地或另外地，可使纳米粒子聚集体与功能剂缀合。可使用任何已知的缀合技术将功能剂与本文公开的聚集体缀合。例如，合适的缀合技术描述于以下文献中：bioconjugatetechniques-第三版；作者：greghermanson；出版社：academicpress；出版日期：2013年8月19日。其他合适的缀合技术对于本领域技术人员将是已知的。纳米粒子聚集体相对于单个纳米粒子的更大尺寸改善了将功能团缀合到聚集体表面的过程。例如，与单个纳米粒子相比，通常可将更多的功能团与纳米粒子聚集体缀合。另外，产生聚集体-功能团缀合物的效率通常大于产生单个纳米粒子-功能团缀合物的效率。可根据聚集体的预期用途来选择可与本文公开的纳米粒子聚集体缀合的功能剂。例如，功能剂可以是与另一分子特异性或非特异性结合的捕获试剂。因此，在一个示例中，功能剂可以是与目标分析物特异性结合的捕获试剂。根据预期的靶实体或靶分子，可使用任何合适的捕获试剂。捕获试剂可以是能够与靶分子形成结合对的任何试剂。示例性结合对包括与对应抗体或其结合部分或片段组合的任何半抗原或抗原性化合物。因此，半抗原或抗原性化合物或抗体可与本文公开的纳米粒子聚集体缀合。在一个优选的示例中，本文公开的纳米粒子聚集体与抗体缀合。如本文所用，术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原结合位点结合靶蛋白和/或其表位和/或其免疫原性片段和/或其修饰形式(例如，糖基化等)的免疫球蛋白分子。该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖包含抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体及其片段或变体的融合多肽，所述片段或变体包括例如fab、fab′、f(ab′)2、fv、单链抗体(被定义为包含轻链可变区、重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子；此类单链抗体可以是多聚体形式，例如双抗体、三抗体和四抗体等，它们可以是或可以不是多特异性的)和单结构域抗体。该术语还涵盖包括抗体的衍生物，例如包含额外组分(例如增加抗体稳定性的毒素和/或化合物)的缀合物。示例性结合对还包括非免疫结合对(例如生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉亲和素)、激素(例如甲状腺素/皮质醇)-激素结合蛋白、受体-受体激动剂或拮抗剂(例如乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)、igg-蛋白a、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-抑制剂、适体-抗原和能够形成核酸双链体的互补多核苷酸对等。如本文所用，术语“多核苷酸”包括dna、rna或这些(单链或双链、有义或反义方向或两者的组合)的组合、dsrna或其他。多核苷酸可包括增强其稳定性的任何修饰，并且可以是足以与靶多核苷酸结合的任何长度。捕获试剂可能够与靶分子特异性结合。“特异性结合”是指捕获试剂以比存在于含有靶分子的样品中的其他分子更大的亲和力结合靶分子。因此，在一个示例中，本文公开的纳米粒子聚集体可用于结合取自受试者的样品中的特定靶蛋白或多核苷酸。可通过本领域已知的任何合适的方法将捕获试剂与纳米粒子聚集体缀合。捕获试剂可直接或经由一个或多个接头间接地与纳米粒子聚集体缀合。捕获试剂的直接连接意味着聚集体外表面上的功能团和结合剂本身充当化学附接点。在这种情况下，外表面可被具有诸如硫醇、胺、羧基、羟基基团等的反应性基团的功能有机分子修饰。合适的表面活性反应物包括但不限于脂族和芳族胺、巯基羧酸、羧酸、醛、酰胺、氯甲基基团、酰肼、羟基基团、磺酸盐、硫酸盐和其他适应此类直接连接的物质。当捕获试剂与纳米粒子聚集体的外表面的附接经由一个或多个接头(或“间隔物”)发生时，合适的接头可包括(但不限于)脂质、多肽、寡核苷酸、聚合物等。可用于纳米粒子聚集体的功能化的其他化学物质包括聚合物、硅烷、表面活性剂、生物试剂和金属氧化物涂层。另外，干燥的纳米粒子聚集体可通过将聚集体暴露于沉积在聚集体表面上的化学蒸气而被功能化。可沉积的涂层的示例包括硅烷、其他金属氧化物前体和聚合物。也可施加疏水、亲水和无孔涂层。通常(无论是否处于干燥状态)，纳米粒子聚集体可在流化床、v型混合机、斜锥混合机、研磨机、声混合器(例如labram)、振荡器和振动器中进行涂覆。在涂覆之后，纳米粒子可保持在干燥状态或者可分散在溶剂中，并通过诸如研磨、超声处理、微流化或均化的方法解聚。替代地或另外地，可配制纳米粒子聚集体以用于它们的预期用途。这可包括在合适的储存缓冲液中配制纳米粒子聚集体。因此，本文公开的方法可以包括将纳米粒子聚集体重悬于储存缓冲液中。替代地，可将纳米粒子聚集体干燥。干燥可通过许多方法完成，包括加热干燥、蒸发干燥、旋转蒸发干燥、快速真空干燥、冷冻干燥、超临界干燥和喷雾冷冻干燥。因此，本文公开的方法还可包括干燥纳米粒子聚集体。另外，可将本文公开的纳米粒子聚集体掺入到任何种类的药学上或美容上可接受的组合物中。例如，可将聚集体添加到溶液、胶体分散体、乳液(水包油或油包水)、悬浮液、粉末、粉底、霜膏、唇膏、洗剂、凝胶、泡沫、摩丝、喷雾剂等中。用于配制不同媒介物类型的方法在本领域是众所周知的，并且可见于例如remington的thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，第ii卷。测定形式本公开还提供了本文公开的纳米粒子聚集体在任何形式的测定中的用途。例如，该测定可以是免疫测定。示例性免疫测定包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、竞争测定、放射免疫测定、侧向流免疫测定、流通免疫测定、基于浊度的测定、基于比浊法的测定、基于荧光激活细胞分选(facs)的测定、免疫组织学、免疫化学、微阵列等。在一个优选的示例中，本公开提供了所公开的纳米粒子聚集体在侧向流测定(诸如侧向流免疫测定)中的用途。本文公开的纳米粒子聚集体可用于本文所述的任何测定中，以确定生物样品中任何分析物(诸如靶蛋白或核酸)的存在。试剂盒本公开另外提供了一种试剂盒，其包含如本文公开的纳米粒子聚集体。纳米粒子可以溶液或干燥形式提供。任选地，本公开的试剂盒与使用说明书一起包装。例如，说明书可告知使用者如何在本文所述的测定方法中正确地使用纳米粒子聚集体。因此，在一个示例中，说明书可告知使用者如何在诊断与从受试者获取的样品中的分析物相关的疾病、病症或生理状况的方法中正确地使用纳米粒子聚集体。实施例参考以下非限制性实施例进一步描述本公开。实施例1：纳米粒子聚集体的自组装选择量子点纳米晶体(在本文中称为“qdot”)(lifetechnology，q21371mp)进行分析。这些qdot是由核-壳结构组成的纳米晶体，该核-壳结构在合成过程中用稳定疏水剂进行封端。通过生成两亲性涂层在合成后对表面进行修饰。两亲性涂层具有与稳定疏水剂相互作用的疏水性基团和提供水溶性并减轻非特异性相互作用的亲水性基团。它还引入了用于下游生物功能化的功能部分(例如，用于常规碳二亚胺化学反应的羧基基团)。结果，qdot形成了具有高度单分散性特征的高度稳定的胶体。本研究中所用的qdot的z-电势约为-30mv。qdot保持在储存缓冲液(50mm硼酸盐缓冲液)中，然后直接(与储存缓冲液一起)转移到由4∶1的甲醇∶1，2丙二醇中的5％四氢呋喃(thf)组成的溶剂混合物中。一旦将qdot转移到溶剂混合物中，立即触发聚集过程。在相对长的时间段(1-3小时)内发生聚集，并且产生qdot的致密的核(图2)。在聚集阶段结束时，纳米粒子聚集体通过在10,000rcf下离心8分钟来分离，并重悬于水中，在这种情况下它们表现出良好的胶体稳定性(未观察到明显的絮凝)。实施例2：摩尔浓度影响纳米粒子的聚集速率为了更好地理解实施例1中观察到的驱动自组装的物理机制，对溶液的摩尔浓度如何影响聚集进行了研究。通过向悬浮在储存缓冲液(50mm硼酸盐缓冲液)中的qdot中添加体积逐渐增加的去离子水来改变反应混合物的摩尔浓度。这有效地将qdot储存缓冲液的摩尔浓度从50mm降低至10-11mm。将悬浮在不同浓度的储存缓冲液中的qdot直接转移到溶剂混合物(4∶1的甲醇∶1，2丙二醇中的5％四氢呋喃(thf))中，从而形成反应混合物。这有效地改变了反应混合物的摩尔浓度。在反应混合物中温育1小时后，通过在10,000rcf下离心8分钟，从单个qdot中分离形成的纳米粒子聚集体。将沉淀重悬于水中，然后用来估计作为缓冲液摩尔浓度的函数的聚集效率(由每个聚集体中单个qdot的数量确定)。如图3所示，在摩尔浓度和聚集产率(纳米粒子聚集体中存在的单个qdot的数量)之间观察到线性关系，其中最佳摩尔浓度在10.5-10.7mm的范围内。实施例3：摩尔浓度对纳米粒子聚集体荧光强度的影响通过测量上清液和团聚体的荧光强度，在实施例2中显示出产生更高聚集体产率的摩尔范围(10.5-10.7mm)内对聚集过程进行进一步分析。简而言之，通过添加去离子水将提供在50mm硼酸盐缓冲液中25μl的qdot原液的等分试样稀释至期望的摩尔浓度。将92μl聚集缓冲液(4∶1的甲醇∶1，2丙二醇中的5％四氢呋喃(thf))添加到混合物中以触发聚集，并在室温下温育60分钟。在温育结束时，将1μl溶液转移到含有99μlh2o的96孔板的孔中。将样品在10,000rcf下离心8分钟，并将1μl上清液转移至96孔板中以测定荧光强度(＝‘第一次温育后的粒子’)。将该原液在去离子水中另外洗涤3次，并将1μl转移到含有99μl去离子水的96孔板的孔中(＝‘最终测量’)。进行最终测量以验证在洗涤期间没有粒子损失，并且聚集体在聚集后保持稳定。荧光强度以荧光强度的任意单位(相对荧光强度或rfu)表示。如图4所示，上清液的荧光强度随摩尔浓度的降低而逐渐增加。这与发明人先前观察到的聚集产率随摩尔浓度增加相关。聚集体的荧光似乎与摩尔浓度无关。当考虑到在给定的聚集时间内增加的产率等同于更快的聚集动力学时，较高摩尔浓度下的尺寸分布可能偏向更大的聚集体。不希望受理论的束缚，荧光的减少可能是由于当紧密接近时qdot的潜在猝灭(但考虑到小/大型聚集体的聚集体之间的距离相同，这种可能性较小)，或者是由于位于聚集体的核的qdot被埋得太深而无法激发辐射。分别地，通过与上文段落[0112]中所述相同的方案，分析多批qdot的荧光强度以研究可商购获得的产品批次之间的变化性。如图5所示，显示条件(例如，qdot储存条件或表面化学)的微小批次间变化会影响聚集动力学。因此，推荐实时监测纳米粒子聚集体的生长，以确保通过本文公开的方法产生的纳米粒子聚集体的荧光特性的更大均匀性。将聚集体生长的实时监测与聚集期间实验条件的受控变化(例如，反应混合物摩尔浓度)相组合实现了高度可再现的纳米粒子聚集体的产生。实施例4：使纳米粒子聚集体稳定并且功能化在实施例1中所述的聚集条件下，使用izon分析仪(izonscience)对纳米粒子(qdot)聚集体的生长进行实时监测。在聚集过程开始时，反应混合物中不存在聚集体，并且所有qdot均低于izon分析仪的尺寸分辨率。随着时间的推移，粒子计数和平均尺寸逐渐增加，并且当样品的尺寸分布达到预定值时，通过在10,000rcf下离心8分钟使反应停止，然后将沉淀重悬于去离子水中。图6中示出了实时监测聚集体生长的结果。有趣的是，观察到从溶液中耗尽单个qdot后开始进行生长过程，从而导致粒子浓度降低(参见，例如，在插图中t＝250分钟处的数据点)，并且对于长温育时间出现更大的聚集体(参见主图，t240)。聚集过程后，对于qdot聚集体使用可商购获得的qdot稳定方法进一步稳定并使用已知的“点击”化学方法进一步功能化，以将抗流感单克隆抗体(mab)与聚集体缀合。用以下两个测试评估缀合的成功：a)fitc-gam(山羊抗小鼠)。将标记有荧光染料(fitc)的抗小鼠抗体与“点击的”纳米粒子聚集体一起温育。温育后，通过洗涤步骤移除未结合的fitc-mab，并将来自fitc的荧光强度与纳米粒子聚集体的荧光强度相关联。结果示于图7中。所述方法使得能够估计每个纳米粒子聚集体所对应的抗体数量。b)功能测试。对纳米粒子聚集体进行功能测试，并在预定范围内比较使用参考校准器获得的信号幅度。该测试的结果示于图8中。在该对照测试中显示信号幅度在可接受水平内的那些纳米粒子聚集体样品被认为适用于诊断测定。总的来说，已成功地使用已知的缀合化学方法将抗流感单克隆抗体与纳米粒子聚集体缀合，使得它们随后能够用于检测样品中的流感的测定法中。实施例5：纳米粒子表面电荷对聚集的影响在h2o中获得了许多不同的、具有各种表面化学性质(并且因此各种表面电荷)的可商购获得的量子点。通过添加逐渐增加量的2mnacl，将含有qdot的溶液的摩尔浓度调节至期望水平。所使用的量子点列于表1中。表1：具有不同表面电荷的量子点。使表1中所列的量子点经受实施例1中所述的聚集条件。反应混合物的温育在室温下进行。周期性地监测样品的荧光强度，以此作为估计聚集体大小的间接方法。尺寸估计基于这样的原理，即通过离心可从单个qdot(或小聚集体)中分离较大的聚集体，因此，由上清液中未聚集的单个qdot发射的残余荧光随时间的推移而减少，同时发生聚集过程。因此，通过周期性地离心样品并测量上清液的荧光强度来进行尺寸估计。在聚集期间的四个不同时间点处针对三个不同批次的qdot进行测量的这些测量结果的示例示于图9中。除了通过上述荧光强度信号进行尺寸估计之外，还通过动态光散射(dls)测定了残余荧光与纳米粒子聚集体群的平均尺寸之间的相关性。使用dls产生的表示所形成的纳米粒子聚集体的平均尺寸的代表性数据示于图10中。dls揭示了一个以缓慢生长为特征的初始阶段-这归因于成核阶段，其中单个qdot形成初始“种子”，其随后发展以进一步生长。一旦发生初始成核，生长就以线性趋势快速发展。然而，所述方法对环境条件的细微变化(例如，聚集混合物的摩尔浓度或化学计量的波动，如图5所示)敏感。尽管敏感，但该过程可通过具有动态(特定于批次的)持续时间的聚集阶段来可靠地控制，并且具有足够的灵活性以递送高度可再现的纳米粒子聚集体批次。纳米粒子聚集体群平均尺寸的线性增加伴随着离心后上清液中残余荧光的逐渐减少(如图9所示)。因此，可通过监测上清液中的残余荧光强度来验证纳米粒子聚集体的形成。如果聚集不受控制并导致大的聚集，则残余荧光将不会显示逐渐减少，而是更突然且迅速地减少。使表1中所列的量子点经受实施例1中所述的聚集条件的结果汇总于表2中。表2：在固定的聚集条件下具有各种表面电荷的量子点的聚集。从表2所示的结果可以看出，在该实施例中使用的特定聚集混合物导致环境太温和而不能诱导具有高度负表面电荷(例如，由羧酸基团产生)的qdot的聚集，或者导致环境太激进而不能诱导具有轻度负表面或带正电荷表面(例如，由羟基基团或胺基团产生)的qdot的聚集。有趣的是，观察到了通过水性合成产生的量子点(并且其因此不具有两亲性涂层)的聚集。然而，该聚集是可逆的：离心后通过轻微搅动试管，可容易地将聚集体重悬。由于所形成的聚集体高度不稳定，因此这种可逆聚集体几乎没有实用价值。然而，所产生的不稳定聚集体可使用已知的稳定技术(包括本文所述的那些)来稳定。实施例6：摩尔浓度对具有各种表面电荷的纳米粒子的聚集的影响鉴于本文证实可改变反应混合物的摩尔浓度来控制聚集过程，使实施例5中所示的在该实施例中所采用的特定反应条件下不发生受控聚集的那些qdot经受具有不同摩尔浓度的不同反应混合物，以确定是否可改变摩尔浓度来挽回对聚集的控制。表2中的那些在其表面具有羧酸基团的qdot(其z-电势在-50mv至-30mv范围内(与对照批次的约-30mv的z-电势相比))，通过将它们与实施例1中所述的聚集缓冲液(4∶1的甲醇∶1，2丙二醇中的5％四氢呋喃(thf))一起置于摩尔浓度为4mm至7mm的氯化钠溶液中来诱导聚集。如实施例5所述，通过测量给定温育时间后上清液中的残余荧光强度来确定聚集体的形成。证实此类纳米粒子聚集体的受控形成的一个示例的结果示于图11中。然后改变反应混合物的摩尔浓度，以试图诱导具有接近中性电荷的表面基团的纳米粒子(例如peg-oh、nh2qdot)的受控聚集。结合thf的各种百分比含量，测试了宽范围的缓冲液摩尔浓度(0mm至20mm)，以调节聚集环境。这些实验的结果示于图12中。如图12所示，有机溶剂百分比的增加降低了残余荧光强度，表明形成了纳米粒子聚集体。这些发现表明，通过调节反应混合物(即聚集缓冲液)的组成或缓冲溶液(即储存缓冲液和/或反应混合物)的摩尔浓度，可实现表面电荷在-30mv至0mv范围内的qdot的聚集。可控制聚集过程以使其非常迅速。另外，聚集过程可能对环境条件敏感。例如，如果反应混合物中存在小于3％的thf，则具有中性表面的纳米粒子可能是胶体稳定的；然而，简单地将thf含量增加到3.75％即可导致非常快速的聚集。这些发现还表明，该系统具有亚稳态，其中在环境条件发生相对较小的变化时，该系统便从胶体稳定状态转变为聚集状态。虽然本文已证实可调节条件以控制具有中性表面电荷的纳米粒子的聚集，但为了工艺的稳健性和总体的批与批之间的可再现性，强的负纳米粒子表面电荷是优选的。实施例7：有机溶剂对纳米粒子聚集的影响然后，发明人确定，本文公开的方法可使用多种有机溶剂组分，同时仍实现期望且受控的纳米粒子聚集。发明人已证实表3中列出的每种化合物(及其组合)适用于本文公开的纳米粒子的受控聚集。表3：测试作为有机溶剂组分适合性的试剂化合物名称碳的数量-oh基团的数量甲醇11乙醇21丙-2-醇31丁-2-醇41乙-1，2-二醇22丙-1，2-二醇32丙-1，2，3-三醇43所使用的较高分子量化合物导致更粘稠的环境，该环境不会阻碍聚集，但会影响通过离心分离的容易程度。具有最长碳链的醇(例如丁醇)是最不优选的，因为高疏水性尾部表现出诱导量子点非常快速聚集的轻微倾向，并且使得控制聚集体的最大尺寸稍加困难。然而，发现所有这些化合物都适用于受控聚集qdot的方法。还应当理解，如本文所证实的，改变其他聚集条件(例如，所使用的纳米粒子的表面电荷、聚集混合物的摩尔浓度等)可使用表3中所列的任何组分或这些组分的组合来优化特别期望的聚集动力学。实施例8：有机溶剂对纳米粒子聚集的影响在可改变所使用的具体有机溶剂同时仍实现纳米粒子聚集体的受控形成的进一步证实中，使用另选的有机溶剂重复实施例1中所述的聚集过程：吡咯烷和二甲基甲酰胺(dmf)代替thf。该实验的结果示于图13中。图13示出了作为在聚集步骤中所使利用的有机溶剂的函数的上清液的荧光强度的时间演变。数据表明，尽管具有不同的动力学，但聚集过程非常类似地发生，而与溶剂无关。dmf导致温和且缓慢的聚集，而吡咯烷比dmf或thf诱导更快地qdot聚集。可通过调节其他参数诸如有机溶剂的浓度或本文所述的任何其他变量(例如qdot表面电荷、缓冲液摩尔浓度等)来进一步控制聚集过程的特定动力学。实施例9：聚集时间对纳米粒子聚集体尺寸的影响使用dls来监测聚集时间对形成的纳米粒子聚集体尺寸的影响。重复实施例1中所述的聚集过程，并在聚集过程开始后的不同时间点进行dls测量。该实验的结果示于图14中。dls数据清楚地表明，延长聚集过程产生逐渐更大的聚集体(聚集体的平均流体动力学半径在30nm至100nm的范围内)。单个量子点具有约15nm的流体动力学半径。在进一步的表面封闭和抗体功能化之后，粒径增大到200-220nm。然后，发明人进一步证实，本文公开的方法产生了尺寸均匀的纳米粒子聚集体。表4提供了使用三个不同批次的单个纳米粒子形成的纳米粒子聚集体的平均粒度和多分散性指数的汇总，其证实了批与批之间的高可再现性。如上所述，在进一步表面封闭和与抗流感抗体缀合后，使用dls进行尺寸测量。术语“多分散性指数”用于描述分布的“不均匀”程度。完全单分散分布的特征在于pdi＝0，并且pdi＞0.4通常是广泛多分散的纳米粒子群的指标。如表4所示，所制备的每批纳米粒子聚集体的pdi很低，证实每批中产生的纳米粒子聚集体的尺寸高度均一。表4：所使用的三个单独批次的粒子的平均尺寸和多分散性指数(pdi)。实施例10：纳米粒子聚集体的增强的荧光本文公开的荧光纳米粒子聚集体的特征在于高亮度。这种高亮度被认为是由每个聚集体中的大量单个纳米粒子引起的。因此，由于聚集体所产生的信号比使用与相同捕获试剂缀合的单个纳米粒子产生的信号更强，因此可更可靠地检测已与捕获试剂缀合的纳米粒子聚集体和分析物之间的结合事件。为了证实此优点，发明人用链霉亲和素使单个量子点功能化，随后用抗流感的生物素化抗体涂覆单个量子点。对纳米粒子聚集体进行相同的功能化，以提供由功能化单个量子点产生的信号与由本文公开的功能化纳米粒子聚集体产生的信号之间的直接比较。测量在与对照流感抗原结合时由单个量子点产生和由纳米粒子聚集体产生的荧光强度信号。结果示于图15中。如图15所示，由纳米粒子聚集体产生的荧光信号明显强于由单个纳米粒子提供的荧光信号。要产生与由浓度低得多的纳米粒子聚集体提供的信号水平相同的信号水平，需要浓度高得多的单个纳米粒子。然后，发明人比较了单个纳米粒子与纳米粒子聚集体相比的相对测定性能。将两种类型的构建体部署在侧向流测试条上，并测量在与不同浓度的流感抗原(流感核蛋白)结合时产生的信号。使用夹心免疫测定法，每次测试使用相等的摩尔浓度或相等的粒子载量，确定相比于纳米粒子聚集体从单个纳米粒子构建体获得的相对检测下限。单个纳米粒子的浓度由原料供应商提供。通过元素分析(即icp-ms)估计聚集体构建体的浓度。通过将特异于甲型流感核蛋白的捕获抗体固定在硝酸纤维素膜区段中的离散位置上，制备免疫层析测试条作为固相。将单个纳米粒子或聚集体构建体固定在固相上游的释放垫中。在模拟基质中制备分析物的稀释系列，然后将其加载到测试条上以启动色谱分析。使用薄层色谱扫描仪对免疫色谱测试条响应于每种分析物浓度所发射的荧光强度进行测量。结果示于图16中。如图16所示，与单个功能化纳米粒子相比，功能化纳米粒子聚集体能够检测以低100倍浓度存在的流感抗原。这显著提高了测定的灵敏度。因此，当用于诊断领域(诸如医学诊断)时，本文公开的纳米粒子聚集体是特别有利的。在一个具体示例中，当用于侧向流测定中(诸如侧向流免疫测定中)时，本文公开的纳米粒子聚集体是特别有利的。实施例11：温度对纳米粒子聚集的影响为了理解温度在本文公开的纳米粒子聚集过程中的影响，在不同温度下进行实施例1中所述的聚集过程：室温、30℃和37℃。该实验的结果示于图17中。如图17所示，聚集过程的动力学没有显著变化，然而，升高的温度导致更快的聚集动力学。因此，可通过在聚集过程期间改变温度来控制聚集速率。例如，可通过提高进行聚集过程的温度以增加聚集速率。实施例12：有机溶剂对具有不同表面电荷的纳米粒子聚集的影响为了证实在使用具有不同表面电荷的纳米粒子时有机溶剂的具体选择对聚集过程保持影响，发明人使用由-nh2和聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)基团封端的带正电荷的量子点重复实施例8中所述的实验。这两种表面化学物质通过带正电荷的聚合物刷来对纳米粒子进行封盖。-nh2量子点具有peg聚合物薄层和低密度的带正电荷的功能团(z电势约0mv)，而pdda基团密集地堆积在厚的聚合物刷上(z电势约+40mv)。该实验的结果示于图18中。如图18所示，吡咯烷酮(具有较快动力学的溶剂，并且因此是更有效的溶剂)可使具有正表面电荷的pdda涂覆的纳米粒子聚集。可用效力较低的有机溶剂(thf，参见图12)使轻度带电的纳米粒子(-nh2)聚集。当前第1页1 2 3