微珠芯片及其旋涂制备方法与流程

本发明涉及生物芯片技术领域，具体地说，是一种微珠芯片及其旋涂制备方法。

背景技术：

相比测序技术而言，高密度生物芯片拥有成本低、检测位点量大、格式统一、分析快等优势。利用生物芯片技术，英国、美国均已建立了大规模人群的基因库。新冠肺炎疫情背景下，欧洲、美国启动了对新冠患者的群体基因组检测，并采用了生物芯片技术，研究基因和新冠易感性之间的关系。通过自主研发生物芯片，基因检测成本将大幅下降，可用于广泛的中国人群体基因组检测。

密封的生物芯片中，微结构加工属于常见的技术，在微结构加工中微球随机进入预先加工好的微结构中，并不易人工的控制，因此微球的进入效率是有上限的。微球进入微结构的效率符合泊松分布。因此，常规的微球进入方法存在多种缺点，例如微球进入效率不高，微球不能准确进入微结构的内部等。

中国专利文献cn101916717a一种直接液冷芯片的强化沸腾传热表面的制备。本发明采用了制备光子晶体的方法：lb膜法、自组装法或旋涂法；将胶体微球组成规则排列的单层或多层胶体晶体薄膜。然后再以这种薄膜为模板，利用溶胶-凝胶法填充模板，最后利用煅烧或溶解的方法去除模板在基片表面制备出二维或三维强化沸腾传热表面。这种强化沸腾传热表面在管道式的自然循环冷却系统中具有良好沸腾传热性能，且制备方法简单、造价低廉。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微珠芯片及其旋涂制备方法，已解决现有技术中微珠入孔率低、稳定性差的技术问题。

本发明的第一方面，提供一种微珠芯片的旋涂制备方法，包括以下步骤：

a、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔；

b、装载二氧化硅微球：

将固体二氧化硅微球注入超纯水中，经过超声分散配制成浓度为5mg/ml～50mg/ml的单分散的二氧化硅胶体溶液；

在留有剩余光刻胶的单晶硅板中间滴入一定量的上述二氧化硅胶体溶液，开启旋涂装置10s～30s；干燥；

利用化学溶剂将单晶硅板表面的光刻胶去除，清洗，干燥。

进一步的，所述的步骤a中，小孔的深度约为1um～2um。

进一步的，所述的步骤b中，超声分散功率80w，时间2h。

进一步优选的，所述的步骤b中，单分散的二氧化硅胶体溶液浓度为5mg/ml。

进一步的，所述的步骤b中，滴入二氧化硅胶体溶液550ul～2400ul。

进一步的，所述的步骤b中，旋涂装置固定转速500rpm～1200rpm。

进一步的，重复步骤b中的旋涂数次(3～次)。

进一步的，所述的步骤b中，化学溶剂由体积比2:1的98％浓硫酸与双氧水配置而成。

进一步的，所述的步骤b中，固体二氧化硅微球为共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球，其制备方法包括以下步骤a-c：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

将二氧化硅微球配制成10mg/ml～200mg/ml的二甲苯悬浮液；加入硅烷化试剂，硅烷化试剂在混合液中的体积浓度为10％以下，充分反应，使二氧化硅微球表面修饰上氨基；

b.激活二氧化硅微球

将步骤a获得的表面修饰上氨基的二氧化硅微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为10mg/ml～200mg/ml；加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，摇晃反应；用乙腈清洗去除多余反应物，再让二氧化硅微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，调ph值至7.5～8.5；

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2m的氯化钠溶液溶解，与步骤b获得的二氧化硅微球硼酸钠悬浮液混合，其中二氧化硅微球含量为10～100mg，震荡反应5～8小时后进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液；清洗、干燥。

进一步的，所述的步骤a中，二氧化硅微球粒径为500nm～5um(优选3um)。微球的cv<5.0％。

进一步的，所述的步骤a中，二氧化硅微球配制成100mg/ml的二甲苯悬浮液。当微球浓度低于10mg/ml时，反应体积较大，寡核苷酸链的浓度相应较低，偶联效率大幅降低，若要达到相同或相似的效果，需要加入过量的寡核苷酸链，造成浪费；当微球浓度大于200mg/ml时，微球悬浮液接近胶状，较难进行混匀等操作。

进一步的，所述的步骤a中，硅烷化试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷。本发明采用硅烷化试剂使二氧化硅微球硅烷化后表面带上氨基，再通过三聚氰氯作为连接物偶联上寡核苷酸链，通过氨基连接比巯基更稳定。

进一步的，所述的步骤a中，硅烷化试剂在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。

进一步的，所述的步骤b中，微球的质量浓度为100mg/ml。

进一步的，所述的步骤b中，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3m，三聚氰氯浓度为0.1m。步骤b中选择二异丙基乙胺和三聚氰氯活化氨基的原因：二异丙基乙胺为催化剂，三聚氰氯为实际连接物，选择其原因为三聚氰氯上的cl活性高，易与寡核苷酸链发生缩合，反应产物也较稳定。

进一步的，所述的步骤b中，硼酸钠缓冲液浓度为0.05m～2m。微球悬浮液选择硼酸钠缓冲液是为了保证ph值，使反应在弱碱性环境发生，以利于寡核苷酸链与微球的连接反应，同时保护寡核苷酸链碱基内部的氨基不受影响。发明人尝试过氯化钠溶液，中性环境，连接效果较差；尝试过tris缓冲液，弱碱性环境，连接效果差，荧光强度很弱，分析原因为tris中有活性强的氨基，与寡核苷酸链竞争，抢占了可连接的位置。

进一步的，所述的步骤c中，寡核苷酸链的长度为10mer～200mer，末端修饰氨基。低于10mer的太短不稳定，高于200mer的合成上有难度，同时太长会有更多二级结构，也不利于偶联。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球制备方法包括以下步骤：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/ml的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。

b.激活二氧化硅微球

将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/ml。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3m，三聚氰氯浓度为0.1m，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用2m的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的ph值调整至7.5～8.5。

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2m的氯化钠溶液溶解，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。

将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带fam荧光基团)，从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到1000～10000个寡核苷酸链/平方微米。

更进一步的，所述的微珠芯片的旋涂制备方法包括以下步骤：

a、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔，小孔的深度约为1um～2um。

b、装载二氧化硅微球：

将一定量单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80w)配制成一定浓度的单分散的二氧化硅胶体溶液(5mg/ml～50mg/ml)。

在留有剩余光刻胶的单晶硅板中间滴入一定量的上述胶体溶液(550ul～2400ul)，开启旋涂装置固定转速(500rpm～1200rpm)，经过10s～30s，将晶圆置于空气中干燥。重复上述操作3次。

利用化学溶剂将单晶硅板表面的光刻胶去除。并用大量去离子水清洗硅板表面3次。

该方法得到的硅板，硅板上小孔中微球的入孔率可达到99.8％～99.99％。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的制备方法制备得到的微珠芯片。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的微珠芯片在制备生物芯片中的应用。

本发明优点在于：

1、采用本发明的旋涂法使微珠的入孔率达到99.8％～99.99％。

2、优化了制备工艺：本发明在光刻后先不去除光刻胶，直接进行旋涂，部分微球由于重力会落入蚀刻好的小孔中，剩余未落入孔中的微球会附着于光刻胶表面，旋涂后未落入小孔中的微球由于附着在光刻胶表面，会随着去除光刻胶的过程被一并清除，此时所有没有压入小孔中的微珠可以100％清除，同时不影响已经固定好的微珠，入孔后稳定性好。

3、共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球制备方法中，硅烷化试剂的浓度和三聚氰氯的浓度，其分别保证了微球表面氨基的密度和连接基团的密度，以用于最终与寡核苷酸链连接。连接效率可达到1000-10000个寡核苷酸链/平方微米，大大节省了制作成本，为后续生物芯片的制作提供了稳定且保存时间长的共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球产品。

附图说明

图1是本发明实施例2制备得到的产品的显微图片；

图2是本发明实施例3制备得到的产品的显微图片；

图3是本发明实施例4制备得到的产品的显微图片；

图4是本发明对比例1制备得到的产品的显微图片；

图5是本发明对比例2制备得到的产品的显微图片；

图6是本发明对比例3制备得到的产品的显微图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球的制备方法

包括以下步骤：

a.二氧化硅微球表面修饰氨基

原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，粒径3um，将其配制成100mg/ml的二甲苯悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为1.0％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。

b.激活二氧化硅微球

将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/ml。加入二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3m，三聚氰氯浓度为0.1m，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用2m的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的ph值调整至7.5～8.5。

c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链

将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2m的氯化钠溶液溶解(寡核苷酸链的长度为15mer，末端修饰氨基)，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为50mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。

将与寡核苷酸链偶联后的微球，与目标物杂交(目标物与寡核苷酸链互补，末端带fam荧光基团)，在比相应寡核苷酸链的解链温度低20℃的条件下培育30分钟，检测其荧光强度。检测时微球浓度为2mg/ml，所使用的激发/发射滤光片为488nm/520nm。本发明中提到的所有荧光强度均在上述条件下测得。荧光强度与浓度的换算使用标准曲线(由配制的标准物测荧光值得到)：c＝8.797e-7*i-0.0055。其中c为荧光基团的浓度，单位nmol/ml，i为荧光强度。则由荧光强度可以得到荧光基团浓度，又已知微球的量，从而可以计算得到单位表面积上荧光基团的个数。从而计算出参与连接反应的寡核苷酸链的量，以及微球与寡核苷酸链的连接效率。经过多次实验验证，连接效率可达到约9500～10500个寡核苷酸链/平方微米(微球粒径3um，多次测量荧光强度为40048、42619、39890)。

实施例2：微珠芯片的旋涂制备方法

包括以下步骤：

a、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔，小孔的深度约为1um。

b、装载二氧化硅微球：

将一定量单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80w)配制成浓度5mg/ml的单分散的二氧化硅胶体溶液。

在留有剩余光刻胶的单晶硅板中间滴入550ul上述胶体溶液，开启旋涂装置固定转速500rpm，经过10s，将晶圆置于空气中干燥。重复上述操作3次。

利用化学溶剂将单晶硅板表面的光刻胶去除。并用大量去离子水清洗硅板表面3次。

该方法得到的硅板，硅板上小孔中微珠的入孔率达到99.8％，产品显微图见图1。

实施例3：微珠芯片的旋涂制备方法

包括以下步骤：

a、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔，小孔的深度约为2um。

b、装载二氧化硅微球：

将一定量单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80w)配制成浓度50mg/ml的单分散的二氧化硅胶体溶液。

在留有剩余光刻胶的单晶硅板中间滴入2400ul上述胶体溶液，开启旋涂装置固定转速1200rpm，经过30s，将晶圆置于空气中干燥。重复上述操作3次。

利用化学溶剂将单晶硅板表面的光刻胶去除。并用大量去离子水清洗硅板表面3次。

该方法得到的硅板，硅板上小孔中微珠的入孔率达到99.92％，产品显微图见图2。

实施例4：微珠芯片的旋涂制备方法

包括以下步骤：

a、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔，小孔的深度约为1.5um。

b、装载二氧化硅微球：

将一定量单分散的已经与寡核苷酸耦连的固体二氧化硅微球注入分析纯的超纯水中，经过超声分散(2h，80w)配制成浓度30mg/ml的单分散的二氧化硅胶体溶液。

在留有剩余光刻胶的单晶硅板中间滴入1500ul上述胶体溶液，开启旋涂装置固定转速800rpm，经过20s，将晶圆置于空气中干燥。重复上述操作3次。

利用化学溶剂将单晶硅板表面的光刻胶去除。并用大量去离子水清洗硅板表面3次。

该方法得到的硅板，硅板上小孔中微珠的入孔率达到99.9％，产品显微图见图3。

对比例1：

对比例1步骤b中将固体二氧化硅微球溶液配制成浓度1mg/ml的单分散的二氧化硅胶体溶液，其余步骤参数同实施例2。微球入孔率为45％，产品显微图见图4。

对比例2：

对比例2步骤b中每次滴入二氧化硅胶体溶液的体积为100ul，其余步骤参数同实施例2。微球入孔率为5％，且微球在硅板表面分布不均匀，原因是微球溶液在扩散到整个硅板表面之前已经挥发变干，产品显微图见图5。

对比例3：

对比例3步骤b中旋涂装置的转速为2000rpm，其余步骤参数同实施例2。微球入孔率为1％，转速过快导致微球横向收到的离心力远大于重力，故微球不易落入小孔中，产品显微图见图6。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。