紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法与流程

本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法。

背景技术：

1、紫背天葵草为菊科千里光属植物裸茎千里光senecio nudicaulisbuch.-ham.exd.don的全草，记载历史最早可追溯到南北朝雷敩所著的《雷公炮制论》：“如要形坚，岂忘‘紫背’。”因其叶背面皆成紫红色，故被称为“紫背天葵草”。清代《植物名实图考》第十三卷亦将紫背天葵草收录其中。紫背天葵草有许多别名，例如：紫背鹿含草(《滇南本草》)，紫背鹿衔草(《昆明民间草药》)，反背红，草板背红、天青地红、反背绿丸、老母猪花头(《云南中草药》)。夏、秋采收，洗净，干燥。其性辛、微苦，平。有小毒。归心、肝、脾经。具有解毒消肿，活血散瘀，消积的功效。用于月经不调，崩漏带下，水肿，食积，小儿疳积，疮疡肿毒，乳痈；跌打损伤。作为云南地方特色用药，需求量大。但目前关于紫背天葵草含量测定或特征图谱测定等质量控制的文献相对较少，较难准确评价紫背天葵草的质量，存在一定的用药安全隐患。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法，包括以下步骤：

4、1)取紫背天葵草制备供试品溶液；

5、取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸制备对照品溶液；

6、2)分别取对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得紫背天葵草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸的含量；

7、其中，高效液相色谱检测过程中，采用乙腈为流动相a、0.1～0.3wt％的磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，洗脱条件为：

8、0～14min，5％→7％流动相a，95％→93％流动相b；

9、14～22min，7％→12％流动相a，93％→88％流动相b；

10、22～32min，12％→28％流动相a，88％→72％流动相b；

11、32～33min，28％→87％流动相a，72％→13％流动相b。

12、进一步的，高效液相色谱检测的检测波长为330～340nm、流速为0.8～1.2ml/min、柱温为30～40℃。

13、进一步的，对照品溶液中新绿原酸的含量在2.48～79.33μg/ml之间、绿原酸的含量在3.48～111.41μg/ml之间、隐绿原酸的含量在2.46～78.66μg/ml之间和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸的含量在1.44～46.24μg/ml之间。

14、进一步的，供试品溶液是取紫背天葵草，加入浓度为65～75wt％甲醇水溶液，超声提取，过滤制得；

15、其中，紫背天葵草与甲醇水溶液的重量体积比为1g：230～280ml。

16、一种紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法，包括以下步骤：

17、取紫背天葵草制备供试品溶液；

18、对供试品溶液进行高效液相色谱检测，所得不同化学成分的峰面积代入各化学成分相应的标准曲线，分别计算得紫背天葵草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸及4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量；

19、其中，采用乙腈为流动相a、0.1～0.3wt％的磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，洗脱条件为：

20、0～14min，5％→7％流动相a，95％→93％流动相b；

21、14～22min，7％→12％流动相a，93％→88％流动相b；

22、22～32min，12％→28％流动相a，88％→72％流动相b；

23、32～33min，28％→87％流动相a，72％→13％流动相b。

24、进一步的，各化学成分相应的标准曲线分别为：

25、新绿原酸对应的标准曲线为：y＝19213x-4942.5，r2＝0.9999；

26、绿原酸对应的标准曲线为：y＝18826x-1623，r2＝0.9999；

27、隐绿原酸对应的标准曲线为：y＝18865x-1542.3，r2＝1；

28、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对应的标准曲线为：y＝19031x-2650.2，r2＝0.9999。

29、进一步的，各化学成分相应的标准曲线的获得方法如下：

30、取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸共4种化学成分共同制备不同浓度的对照品系列溶液；

31、分别取不同浓度的对照品系列溶液进行高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分相应的标准曲线。

32、进一步的，不同浓度的对照品系列溶液中新绿原酸的浓度在2.48～79.33μg/ml之间、绿原酸的浓度在3.48～111.41μg/ml之间、隐绿原酸的浓度在2.46～78.66μg/ml之间和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸的浓度在1.44～46.24μg/ml之间。

33、进一步的，高效液相色谱检测的检测波长为330～340nm、流速为0.8～1.2ml/min、柱温为30～40℃。

34、进一步的，供试品溶液是取紫背天葵草，加入浓度为65～75wt％的甲醇水溶液，超声提取，过滤制得；

35、其中，紫背天葵草与甲醇水溶液的重量体积比为1g：230～280ml。

36、本发明的紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法的有益效果为：

37、本发明通过构建hplc检测紫背天葵草特征图谱中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸这4个特征峰同时定量的方法，实现对紫背天葵草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸这4个指标成分的定量分析及控制，为后期紫背天葵草物质基础研究过程中，成分与活性研究提供依据，使之发挥更大的药用价值，也为紫背天葵草制剂二次开发提供了有力支撑；

38、由于紫背天葵草的品质受药材来源、种植方法、饮片炮制等因素影响，且紫背天葵草化学成分复杂，将紫背天葵草中的化学成分量化，有利于保证制备的紫背天葵草制剂的质量及疗效；

39、本发明的构建方法通过选择合适的色谱条件和前处理条件，实现了通过一次进样，同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸这4种化学成分的含量，能够快速、简便的获知紫背天葵草的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够一次测定一种或两三种化学成分含量，需要多次调整色谱条件才能完成多种化学成分含量测定的问题，节省了操作步骤，能够实现对4种最主要的化学成分进行定量分析，从而更为全面的控制紫背天葵草的质量，实现了通过同时定量分析紫背天葵草中4种化学成分来控制紫背天葵草质量的目的；

40、本发明的紫背天葵草特征图谱中4个特征峰同时定量的构建方法具有简单快速、稳定可靠、精密度高、易于掌握等优势，能够一次性定量分析4种化学成分，为对于紫背天葵草相关制剂的开发和质量标准制定提供参考；

41、本发明通过调整高效液相色谱条件，筛选合适的参数，实现了通过一次测量，同时对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和4,5-o-二咖啡酰奎宁酸共4种化学成分的完全分离及定量分析，且能够保证这4种化学成分对应的4个特征峰与其它杂质峰有效分离，相互之间无干扰，简化了紫背天葵草的预处理及定量分析步骤；

42、不同溶剂或不同浓度的同种溶剂，对于中药物质中有效成分的提取效率也有所不同，本发明通过选用合适的提取溶剂，从而提高了紫背天葵草的提取效率，进而精准测定紫背天葵草中4种化学成分的含量；

43、由于不同的化学成分在不同的色谱条件下出峰情况(包括出峰时间、出峰分离度和峰面积等)也有所不同，而能否单独出峰(即分离度良好)以及峰值的强弱(峰面积)直接影响该化学成分对应的线性范围(线性范围是指待测化学成分浓度与该化学成分相应的峰值呈线性比例的范围)，本发明通过寻找到合适的洗脱条件和色谱条件以使待测的4种化学成分在检测过程中同时维持良好的出峰情况，并同时保证4种化学成分对应的特征峰的峰值与该化学成分在紫背天葵草制备的供试品溶液中的浓度呈线性关系，且恰好落入线性范围内；

44、在定量分析紫背天葵草中的不同含量的4种化学成分时，由于不同化学成分间相互影响、浓度差距较大，且紫背天葵草中还存在其它化学成分对所需定量分析的4种化学成分造成影响，如何使所有待测成分在一次进样检测过程中均落入特定的线性范围内，这正是本发明的难点所在，本发明通过改变色谱条件成功达到了一次进样同时定量分析紫背天葵草中4种化学成分的目的。