一种实时检测甘蔗梢腐病病原菌自供能生物传感器的制备方法

本发明涉及生物传感，特别涉及一种实时检测甘蔗梢腐病病原菌自供能生物传感器的制备方法，主要用于检测甘蔗梢腐病病原菌。

背景技术：

1、酶生物燃料电池(ebfc)是一种利用酶的氧化还原反应将生物能有效转化为电能的绿色能源装置，因其易于小型化和可作为植入式电源的广阔应用前景而备受关注。基于ebfc的自供电传感系统使得分析检测在不需要外部电源供应的情况下就可实现，可以将目标物的浓度转换为传感器的电信号进行分析和检测，因此自供电生物传感系统比传统电化学传感器响应更快更灵敏、制造过程更加简化，成本也大大降低。

2、甘蔗梢腐病是一种危害甘蔗生产的流行性真菌病害，严重影响我国甘蔗主产区的种植和生产。甘蔗梢腐病由镰刀菌(fusarium spp.)引起，甘蔗梢腐病病原镰刀菌的鉴定一般从形态学和分子生物学两方面进行鉴别研究，在形态学上，病原菌的鉴定方法一般是通过显微镜观察来区分病原菌的形态特征。由于梢腐病病原镰刀菌不易产生有性子囊壳，同时在无性形态无明显差异，所以在某种程度上对病原菌的鉴别研究产生了困难。通过形态学特征进行物种鉴定存在问题，诸如菌丝体色素沉着，分生孢子的形状和大小之类的特征不稳定，并且受培养基的组成和环境条件影响。此外，表型变异丰富，而且需要多年经验累积才可区分密切相关的物种及识别其中的差异。由于形态数据的诸多局限性，使用形态学特征无法完全将镰刀菌鉴定出来。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于ebfc的自供能生物传感器，实现梢腐病病原菌的超高灵敏、高选择性检测，有助于监测梢腐病病原菌的异常表达。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种实时检测甘蔗梢腐病病原菌自供能生物传感器的制备方法，所述自供能生物传感器是基于金纳米颗粒/硫掺杂石墨炔复合物aunps/sgdy、碳布、dna链和纳米酶构建自供能生物传感器的阴极和阳极。

3、优选地，上述技术方案中，所述方法制备得到的自供能生物传感器包括阳极、阴极和电解液，所述阳极为aunps/sgdy/mn3o4@aunps生物阳极，所述阴极为aunps/sgdy/dna链生物传感器；所述电解液包括葡萄糖、[ru(nh3)6]3+的pbs缓冲体系。

4、优选地，上述技术方案中，所述生物阳极的制备方法包括：取0.5-2mg/ml，30～70μl aunps/sgdy滴涂在碳布电极表面，在35-40℃干燥2～4h，滴涂上20～70μl 3～5mg/ml的具有类葡萄糖氧化酶活性的纳米酶，在3-6℃下孵育12～24h，得到生物阳极。

5、优选地，上述技术方案中，所述具有类葡萄糖氧化酶活性的纳米酶为mn3o4@aunps。

6、优选地，上述技术方案中，所述aunps/sgdy的制备方法包括：

7、(1)制备gdy：将80～120mg六烷基(三甲基硅基)乙基)苯(heb-tms)分散在四氢呋喃(thf)溶液中，然后加入1～2ml四正丁基氟化铵(tbaf,1m)，温度保持在0℃并通入氩气搅拌10～20min。用超纯水冲洗三次后采用无水mgso4干燥，过滤。除去溶剂后，将20～50mgheb溶解在50ml的吡啶溶液中。制备好的heb前驱体溶液滴入含有1～2ml四甲基乙二胺(tmeda)、5～10ml吡啶、80～120ml丙酮和几片铜箔的圆瓶中。在70℃的氮气保护下，通过在铜箔上交叉偶联反应48～96h。一旦反应完成，吡啶通过减压蒸发。铜箔上可以看到一层黑色的薄膜。用超声法从铜箔中提取出gdy薄膜，并从溶液中收集。然后用吡啶、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、hcl、乙醇和水依次洗洗涤产物。在60℃下真空干燥，得到粉状gdy；

8、(2)制备sgdy：将5～10mg gdy粉末加入到装有1～3ml浓硝酸容器中超声分散，50～100℃油浴回流3～5h，离心洗涤后，分散到水中超声5～7h，洗涤至中性，干燥后得到氧化gdy；再将5～10mg氧化gdy放于管式炉中，在管式炉上游低温区放置1～2g二苄基硫；在氩气气氛，5-15℃min-1的升温速率，加热到800～900℃并保温100～200min，获得sgdy粉末；

9、(3)制备aunps/sgdy：取1～2mg sgdy加入3～6ml乙酸和6～12ml aunps超声20～40min，得到aunps/sgdy。

10、优选地，上述技术方案中，所述mn3o4@aunps的制备方法包括：

11、(1)制备mn3o4：将1～3g mn(ac)2·4h2o(四水合醋酸锰)称重至250ml圆底烧瓶中，并在25℃下溶解于100～150ml乙醇中以获得均匀溶液。使混合物溶液在120～150℃在聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中反应12～36h。将产物冷却至室温，然后用去离子水和乙醇漂洗数次，并在60℃下真空干燥持续10～15h以获得mn3o4纳米颗粒；

12、(2)制备mn3o4@aunps：将10～30mg的mn3o4纳米颗粒分散在3～6ml四氢呋喃溶剂中，然后加入1～2ml质量浓度为0.1％的haucl4溶液，在25～37℃下搅拌1～3h后迅速加入1～2ml 0.3～0.6m nabh4水溶液，并将混合物搅拌10～15h，洗涤，干燥，得到mn3o4@aunps。

13、优选地，上述技术方案中，所述生物阴极的制备方法包括：

14、(1)将30～50μl aunps/sgdy滴涂在碳布电极表面，37℃干燥2～4h后，将其浸在5～10mg/ml edc/nhs溶液中0.5～1h，水冲洗后涂滴上10～30μl的h1，3-6℃下放置10～15h，加入20～50μl浓度为0.5-2mm的mch反应0.5～1h，洗涤去除过量的mch；

15、(2)将20～50μl链置换产物滴涂于电极表面35-40℃下孵育0.5～2h后用水洗涤，再将20～70μl杂交链式反应产物滴涂于电极表面35-40℃孵育0.5～2h，用0.05-0.5m钠系pbs缓冲液洗涤后得到生物阴极。

16、优选地，上述技术方案中，所述链置换产物的制备包括：将40～70μl 5mg/ml活化的磁珠与1μm，各40～70μl的s1、s2混合，在35-40℃下振荡12～24h,磁铁吸附并分散于100～200μl pbs中；将10～30μl不同浓度的病原菌与40～70μl的磁珠pbs混合，在35-40℃下反应1～2h，产物在5～10μldntps、10～20μl 6u nb.bbvci和5～10μl 2.5u phi29聚合酶的混合物中，在35-40℃下反应1～2h，取上清液得到链置换产物output dna1；

17、优选地，上述技术方案中，所述杂交链式反应产物的制备包括：将0.5～2μm,各40～70μl的h2、h3混合，在35-40℃下孵育1～3h，得到杂交链式反应产物h2/h3。

18、上述方法制备得到自供能生物传感器的应用，将自供能生物传感器用于检测甘蔗梢腐病病原菌。

19、一种实时检测甘蔗梢腐病病原菌自供能生物传感器的制备方法，所述方法包括以下步骤：

20、(1)在不引入目标梢腐病病原菌时，测量传感器的eocv；

21、(2)引入目标梢腐病病原菌后，测量含有不同浓度梢腐病病原菌生物传感器的eocv；

22、其中，上述搭建的无膜葡萄糖/[ru(nh3)6]3+传感器的支持电解液为含5mm葡萄糖、500μm[ru(nh3)6]3+ph 7.4的0.01m pbs缓冲体系。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、(1)本发明构建基于ebfc的自供能生物传感器，ebfc的组装是自供能生物传感器设计的核心，当梢腐病病原菌存在时，电极启动链置换(sda)扩增，实现信号放大，并为后续杂交链式反应(hcr)扩增提供结合位点，此时生物阴极吸附[ru(nh3)6]3+增多，电信号增强。开路电压值与梢腐病病原菌呈正相关，从而实现梢腐病病原菌的定量检测。本发明设计的基于ebfc的自供能生物传感器用于梢腐病病原菌分析，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。

25、(2)本发明所述的自供能生物传感器，检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，自供能生物传感器仅需两根电极，即ebfc的阴阳两极，即可实现检测。测试体系不需额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面发生反应，从而提高了传感器的抗干扰能力。采用开路电压来检测梢腐病病原菌，不仅具有极高选择性，还具有成本低、操作简单等优点。

26、(3)本发明所述的自供能生物传感器，采用sda，hcr进行信号扩增，提高了阴极电子受体[ru(nh3)6]3+的负载量，有效扩大了电信号。aunps/sgdy具有电催化活性高、比表面积大、生物相容性好等优点，作为基底材料在ebfc阴极得失电子，实现对目标物梢腐病病原菌的超灵敏检测，大大提高了检测灵敏度。生物传感器中mn3o4@aunps具有类葡萄糖氧化酶活性，可以避免传统生物酶不稳定、易失活的缺点。

27、(4)本发明所述的自供能生物传感器，无需外加电源，可以摒弃昂贵复杂的电化学工作站和放大器，将其与电容器耦联，可放大检测信号，结合智能手机可实现梢腐病病原菌的实时检测。