一种通过富集蛋白质提升检测灵敏度的电化学检测方法与流程

本发明涉及电化学检测，特别是涉及一种通过富集蛋白质提升检测灵敏度的电化学检测方法。

背景技术：

1、电化学免疫传感器是一种结合了电化学技术和免疫学原理的传感器，它能够通过特定的抗体识别并定量分析目标分子，如病毒、细菌、蛋白质等。这种传感器通常包括一个电极，其表面固定有能够特异性识别目标分子的抗体。针对目标分子为黄瓜绿斑驳花叶病毒时，黄瓜绿斑驳花叶病毒与电极表面的抗体结合时引发电流或者是表面阻抗的变化，从而相应的通过循环伏安法或者是电化学阻抗谱测量。

2、现有的电化学阻抗谱测试中多是通过在玻碳电极的表面设置固相的修饰层用于固定病毒和抗体，用固定在玻碳电极表面的抗体与抗原之间的免疫反应形成抗体-抗原复合物引发电信号的变化。但是一般的固相修饰膜由于自身结构的致密性以及生物相容性的差异，导致电信号变化不明显。

3、cn112305041b公开一种多重定量电化学免疫传感器及其构建方法，传感器包括检测探针，该专利中使用的电化学检测方法为循环伏安法，cv是一种通过在电极上施加线性变化的电压并测量电流来研究电极过程的方法。这种方法可能会导致电极表面的氧化还原反应，从而可能对固定在电极表面的抗体产生影响，不利于工作电极的重复使用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通过富集蛋白质提升检测灵敏度的电化学检测方法，本发明针对属于酸性蛋白质的植物病毒，配合碱性电解液条件，石墨烯对抗原蛋白质的吸附以及碱性环境下石墨烯与待检测蛋白质具有负电性而形成的相互排斥，避免石墨烯和蛋白质之间发生普通的非特异性吸附，突出待检测抗原与对应抗体的特异性结合，再通过交流阻抗谱检测电荷转移电阻，定量的检测蛋白质的浓度，检测过程稳定，降低了非特异性吸附，利于工作电极稳定地反复使用。

2、为解决此技术问题，本发明的技术方案是：一种通过富集蛋白质提升检测灵敏度的电化学检测方法，包括以下步骤：

3、s1、制备电化学免疫传感器；

4、s11、在工作电极表面通过电化学聚合反应原位生成聚多巴胺，聚多巴胺生成于预置在工作电极表面的修饰层，修饰层通过聚多巴胺粘接在工作电极表面；

5、s12、修饰层涂覆有5μl的抗体-磷酸盐缓冲溶液，其中抗体的浓度为0.2mg/ml,抗体受到石墨烯的吸附作用均匀分散于修饰层；

6、s13、将经过s12的工作电极置于37℃培养箱中温育30min,得吸附有抗体的电极；

7、s14、将5μl浓度为5％的聚乙二醇6000滴加在经过s13的修饰层表面固定抗体；

8、s2、将待检测浓度酸性蛋白质滴加于吸附有碱性电解液的修饰层，静置，待检测的蛋白质分散在修饰层，修饰层中的石墨烯吸附酸性蛋白质富集，在电解液和修饰层界面处受到氧化镁颗粒的碱性作用呈电负性的酸性蛋白质与修饰层中在碱性电解液中带负电荷的石墨烯相互排斥从而导致酸性蛋白质在修饰层与电解液的界面处均匀分布，抗原与抗体接触形成特异性吸附；

9、s3、置于碱性电解液中三电极体系实施eis测量，所述三电极体系包括形成特异性吸附的工作电极、作为对电极的铂电极以及作为参比电极的饱和甘汞电极；根据所得交流阻抗谱获得电荷转移电阻，根据工作电极的电荷转移电阻-蛋白质浓度的线性方程计算得到待检测酸性蛋白质的浓度。

10、优选每一工作电极的电荷转移电阻-蛋白质浓度的线性方程的获取方法如下：

11、在吸附有固定量抗体的工作电极表面引入系列已知浓度的抗原，分别在37℃下恒温温育35min，得抗体抗原复合物电极，实施eis测量，根据所得交流阻抗谱获得电荷转移电阻，获得该抗体抗原复合物电极免疫反应的电荷转移电阻-抗原浓度的标准曲线。本发明有效避免了非特异性吸附，有效保证所得修饰层在检测过程中测试数据稳定。

12、优选s11中聚多巴胺生成于预置在工作电极表面修饰层的制备方法包括以下步骤：

13、s111、将氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨混合均匀并搅拌得膏状物涂覆在玻碳电极表面，烘干，得预定位附着在工作电极表面的氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨烯层；

14、s112、将包含有s111所得表面预附着有氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨烯层的工作电极的三电极体系置于溶解有多巴胺的电解液中，电解液的ph值为7.4至7.8，通入氮气去除电解液中的氧气；

15、s113、使用循环伏安法将电解液中的多巴胺原位聚合在电极表面的氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨烯层，在电化学聚合过程中，石墨烯表面的氧化镁颗粒作为碱中心催化多巴胺在石墨烯表面聚合并将修饰层通过聚多巴胺粘接在工作电极表面。通过循环伏安法，预置在电极表面的氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨烯延展于工作电极作为聚多巴胺覆盖和填充的界面，通过聚多巴胺将修饰层粘接在工作电极表面的同时，也包围了修饰层中的氧化镁颗粒，有效抑制蛋白质与氧化镁颗粒的直接接触，避免了氧化镁颗粒捕获或者富集待检测抗原；由于石墨烯与蛋白质之间的直接吸附是一个复杂的过程，涉及静电引力、范德华力、π-π堆积作用、氢键等，蛋白质与石墨烯或者氧化石墨烯之间的吸附是非选择性的，二者难以分离，不利于电化学免疫传感器的重复使用，本发明构建的工作电极的修饰层有效避免了氧化镁颗粒和石墨烯材料与蛋白质之间的相互作用。

16、优选s113中循环伏安法的工艺参数如下：

17、电压扫描范围为-0.5v至0.5v，扫速20mv/s，循环10次。

18、优选s113步骤中多巴胺与氧化石墨烯的质量比为（5至8）:1。

19、优选氧化镁颗粒/石墨烯复合材料与氧化石墨烯的质量比为（2至4）：1。本发明利用氧化石墨烯配合氧化镁颗粒/石墨烯，加强聚多巴胺在电化学聚合前或者是形成过程中氧化镁颗粒/石墨烯与工作电极表面的稳定连接，从而在循环伏安的电化学聚合过程中保证稳定的电流传递。氧化石墨烯表面大量的含氧官能团如羟基（-oh）、环氧基（-o-）、羧基（-cooh）等，这些官能团增加了氧化石墨烯的极性，使其能够通过氢键、离子键或共价键与电极表面形成更强的相互作用，提高氧化石墨烯在电极表面的附着力。另一方面氧化石墨烯的表面通常比石墨烯更粗糙，这种粗糙度可以提供更多的接触面积，从而增强修饰层与电极表面的机械附着力。与此同时，氧化石墨烯在水中的分散性较好，配合改善氧化镁颗粒/石墨烯复合材料在水中的分散性能。

20、优选氧化镁颗粒/石墨烯制备方法包括以下步骤：

21、a11、向氧化石墨烯水分散液中加入硝酸镁溶液，搅拌均匀；

22、硝酸镁与氧化石墨烯的质量比（3至6）：1；

23、a12、向a11所得混合体系中滴加氨水至混合体系的ph值为9至10；保持搅拌至镁完全沉淀在氧化石墨烯表面；

24、a13、将a12所得物料体系进行微波水热反应得氢氧化镁/氧化石墨复合前驱体；

25、a14、将氢氧化镁/氧化石墨复合前驱体高温煅烧还原得氧化镁/石墨烯复合材料。本发明使用固体碱催化剂氧化镁颗粒促进多巴胺聚合粘接在工作电极表面，且由于氧化镁颗粒/石墨烯一般处于界面间，尤其氧化镁颗粒/石墨烯在水中的分散性不佳，制作预置层时，氧化镁颗粒/石墨烯之间容易发生团聚，因此暴露于聚多巴胺溶液中的氧化镁颗粒催化多巴胺的聚合反应并对氧化镁颗粒进行包覆，针对性的提升所得修饰层的稳定性和导电性。由于聚多巴胺形成于修饰层表面，有效形成于修饰层表面以及修饰层与工作电极之间的界面，提升修饰层的结构稳定性，同时保证抗体抗原特异性吸附形成后对修饰层界面的影响有效通过电子传递反映。

26、本发明在修饰层中引入氧化镁颗粒，有效促进多巴胺聚合的效率，预定位附着在工作电极表面的氧化镁颗粒/石墨烯以及氧化石墨烯修饰层，通过聚多巴胺快速将修饰层粘接在工作电极表面，且石墨烯、氧化镁和工作电极表面的接触有效形成导电网络，延展了电化学反应的界面并且针对电化学信号的变化敏感。

27、优选a13中微波水热反应的工艺条件如下：

28、反应温度为140℃至180℃；

29、反应时间为30分钟至45分钟。

30、优选a14中高温煅烧的工艺条件如下：

31、氮气保护下，500℃至650℃煅烧1小时至2小时。

32、优选s3中碱性电解液为ph值为7.4至7.8的pbs缓冲液以及

33、0.5mmol/lk4[fe(cn)6]/0.5mmol/lk3[fe(cn)6]/0.1mol/lkcl，

34、其中0.5mmol/lk4[fe(cn)6]/0.5mmol/lk3[fe(cn)6]/0.1mol/lkcl表示碱性电解液中包含0.5mmol/lk4[fe(cn)6]、0.5mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl。

35、现有技术中豇豆退绿斑驳病毒（ccmv）的等电点为3.7，雀麦花叶病毒(bmv)的等电点为5.2，牛血清蛋白的等电点为4.7，在电解液溶液ph值为7.4至7.8且修饰层分布有氧化镁颗粒协同的条件下，待检测的抗原蛋白质均呈电负性，整体上石墨烯层对蛋白质具有吸附作用形成抗原分子富集，二者则由于具有相同的电负性而发生排斥，仅当抗原和抗体之间特异性识别后抗原进一步吸附在修饰层。

36、通过采用上述技术方案，本发明的有益效果是：

37、现有技术中利用go表面的π-π共轭体系对蛋白质的亲和力，可以与蛋白质产生疏水相互作用；go表面的含氧基团可以与蛋白质产生静电相互作用和氢键相互作用，这三种作用相互结合使得氧化石墨烯对蛋白质具有很高的吸附容量，但是由于go对蛋白质的无差别吸附，导致部分抗原蛋白质分子吸附石墨烯表面但是没有与修饰表面的抗体形成特异性吸附，多次使用后修饰层表面吸附的蛋白质分子数量增加，降低了特异性吸附的检测灵敏度以及重复性和稳定性。基于上述现有问题，本发明构建氧化镁颗粒/石墨烯-氧化石墨烯修饰层并通过聚多巴胺粘接在工作电极表面，有效导电的同时延展了电化学反应的界面，石墨烯在碱性溶液以及氧化镁颗粒的作用下带负电，待检测的酸性蛋白质在电解液和氧化镁颗粒共同的碱性影响下也带有负电荷，从而避免了待检测的蛋白质分子直接吸附在修饰层的石墨烯或者氧化石墨烯表面，同时，促进酸性蛋白质在碱性条件下的均匀分散，促进所得抗原-抗体发生特异反应引起修饰层表面电阻变化；

38、本发明利用预置层中石墨烯负载的氧化镁颗粒促进da分子在电场作用下发生电催化聚合反应，反应过程中，da的羟基（-oh）与氧化镁作为碱中心提供的羟基形成氢键，而da的苯环及rgo的六元碳环之间存在π-π键结合作用，pda原位沉积于rgo-mgo表面，形成于修饰层中以及修饰层与工作电极表面之间，pda有效增加了修饰层与工作电极表面的粘接强度，促进工作电极和修饰层的多次重复使用。

39、本发明利用当ph值大于病毒等电点时，尤其是在接近氧化镁颗粒附近时，氧化镁颗粒的强碱效应强化了蛋白质与石墨烯表面的电负性，二者之间的静电排斥作用减弱了石墨烯材料对蛋白质的吸附效果，同时聚多巴胺层有效阻隔了氧化镁颗粒与抗原蛋白质的接触，抑制抗原因为氧化镁颗粒而形成的吸附和聚集，因此保证本发明中抗体与抗原之间的特异性吸附，弱化石墨烯材料与抗原之间的一般性即非特异性吸附，提升检测的灵敏度以及重复性和稳定性。