一种用于促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因及其协同蛋白和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种用于促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因及其协同蛋白和应用。

背景技术：

1、随着地球的资源快速消耗，环境污染的现象日益严重，能源危机的情况随即产生，替代能源木质纤维素引起了广泛关注，木质纤维素是自然界中最广泛、最丰富的碳水化合物之一，作为可再生的生物资源，有望成为生产生物燃料和生物化学品的最丰富的原料。

2、纤维素是世界上最丰富的可再生资源,但一直没有得到充分利用。传统的理化方法降解纤维素时，存在很多问题,如反应条件剧烈、设备昂贵、后处理存在环境污染以及生产成本较高,而利用微生物降解纤维素因经济、有效、节约成为当前热点之一。在利用微生物降解纤维素过程中，纤维素酶是必不可少的，然而，木质纤维素的复杂结构和难降解性以及纤维素酶的效率低是酶水解的障碍。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种于促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因及其协同蛋白，该协同蛋白能够促进纤维素酶酶解木质纤维素。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种于促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因，所述协同蛋白基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

4、进一步的，本发明提供了一种促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因编码的协同蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqid no.2所示。

5、进一步的，本发明提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒含有上述促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白基因。

6、进一步的，本发明提供了一种重组菌，所述重组菌是通过将上述重组表达质粒转化宿主细胞而获得。

7、进一步的，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8、上述协同蛋白的表达方法为：分析协同蛋白序列，去除信号肽，根据去除信号肽部分核苷酸序列设计引物，通过pcr的方法获得编码基因seqid no.1片段，协同蛋白基因以pcold i为质粒构建重组表达质粒pcold i-0597，以大肠杆菌e. coli bl21(de3)为表达宿主，实现c.bescii dsm 6725协同蛋白0597的表达。

9、进一步的，本发明还提供了上述协同蛋白的制备方法，包括培养重组菌，通过诱导蛋白表达、纯化从而获得协同蛋白0597的步骤，具体如下：

10、（1）  c.bescii协同蛋白0597编码基因的克隆

11、根据基因序列设计以下引物f1和 r1，以 c.bescii总dna为模板进行pcr。

12、上游引物f1:5’-ccgctcgaggtagtgacgggatttggtg -3’

13、下游引物r1:5’- cgcggatcctcatttctttcttcctgtcttct -3’，

14、划线部分分别为 xhoi 和 bamhi酶切位点，酶切位点前为保护碱基。

15、pcr反应在50 μl体系中进行，反应按如下条件进行：pcr反应程序为94 ℃预变性5min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1min 30 s；30个循环；72℃延伸10 min 。

16、pcr产物经过1.0%琼脂糖回收预期大小的片段，与pmd19-t载体16 ℃过夜连接，转化入大肠杆菌 e. coli jm109感受态细胞，涂布在lb平板（添加100 μg/ml amp）上，挑取单克隆进行培养后提质粒进行pcr验证，验证正确的质粒载体送生工生物工程上海(股份)有限公司测序，测序正确的重组表达载体及为重组克隆载体pmd19-0597。

17、（2）重组质粒的构建

18、将获得的pmd19-0597重组克隆载体用 xhoi和 bamhi进行双酶切，回收目的片段，并与同样经过 xhoi和 bamhi双酶切的载体pcold i 16 ℃过夜连接，连接产物pcold i-0597转化 e. coli bl21(de3)感受态细胞，涂布于lb平板（添加100 μg/ml amp），37 ℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切验证，验证正确的质粒载体送生工生物工程上海(股份)有限公司测序，测序正确的重组表达载体及为重组表达载体pcold i-0597。

19、（3） 协同蛋白的表达

20、将含有重组表达载体pcold i-0597菌株 e. coli bl21(de3)接种至lb液体培养基（添加100 μg/ml amp），37℃、200 r/min摇床培养过夜；然后按1%的接种量转接到新鲜液体lb培养基（添加100 μg/ml amp）中，37℃、200 r/min摇床培养至od600nm约为0.8后，加入iptg至终浓度为0.25 mmol/l，16℃、200 r/min诱导培养6 h，离心弃上清。将细胞用50mm tris-hcl(ph7.5)缓冲液重悬，冰浴超声波破碎菌体，超声条件为：55w、超声2 s停8s、时间10min，超声后4℃、10000 r/min离心20 min， 取其上清液，进行sds-page电泳分析。

21、（4）协同蛋白0597的分离纯化

22、将上述获得的含有协同蛋白0597的重组菌发酵液于4°c，8000 rpm离心 10 min，去除上清；

23、离心收集的细胞悬浮于缓冲液a （50 mm tris-hcl，ph7）中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200w功率下工作300次，每个循环工作2s停9s；

24、细胞裂解液4 °c 下10， 000 rpm 离心30 min， 所得上清液即为无细胞抽提液。取无细胞抽提液用0.45 μ m滤膜过滤制备成上样样品，将ni-nta琼脂糖凝胶柱用缓冲液a冲洗至平衡，冲柱流速2 ml/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1 ml/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液a~含500 mm咪唑的缓冲液a梯度洗脱，洗脱流速2 ml/min，分别收集各阶段洗脱峰，通过sds-page分析纯化后的协同蛋白0597的分子量大小和纯度。

25、进一步的，本发明提供了上述协同蛋白在促进纤维素酶水解木质纤维素中的应用.

26、具体的，以滤纸为底物，确定其促进纤维素酶水解滤纸的最适反应的底物量、时间、纤维素酶量、协同蛋白0597量：底物量为20 mg/ml，水解时间24 h，纤维素酶量0.09fpu/g纤维素，协同蛋白0597的量为300 μg/ml。反应后，采用dns法测定还原糖的含量。

27、进一步的，所述底物为滤纸、微晶纤维素、棕榈粕、小麦秸秆、水稻秸秆或玉米秸秆。

28、本发明的有益效果为：

29、一、本发明所涉及的具有促进纤维素酶水解木质纤维素协同蛋白0597首次报道在e. coli bl21(de3)中表达并将其应用；本发明公开了一种促进纤维素酶酶解木质纤维素的协同蛋白及其编码基因和应用，该协同蛋白基因，它具有seq id no.1所示的核苷酸序列，全长1503bp个核苷酸，编码含478个氨基酸的协同蛋白及一个含有22个氨基酸的信号肽。

30、二、以pcold i为表达质粒，以大肠杆菌e. coli bl21(de3)为表达宿主，实现了c.bescii 的协同蛋白0597的表达，重组协同蛋白0597表现出促进纤维素酶酶解木质纤维素，此0597的功能为首次研究并报道具有促进纤维素酶酶解木质纤维素的功能。

31、三、协同蛋白0597以滤纸为底物测定其对促进纤维素酶酶解木质纤维素能力时，最适滤纸的量为20 mg/ml，水解时间18 h，协同蛋白0597的量为300 μg/ml，纤维素酶量0.03 pfu/g纤维素，在此条件下产还原糖的量为未加协同蛋白0597的量的4.8倍。

32、四、协同蛋白0597对纤维素酶水解滤纸、微晶纤维素、棕榈粕、小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆均具有促进作用，水解产还原糖量为单独使用纤维素酶水解产还原糖量的2.2-6.5倍，在能源、饲料和食品等行业中具有很好的应用前景。