一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法

本发明属于药物检测，具体涉及一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法。

背景技术：

1、非甾体类抗炎药(nsaids)由于品种多样，价格低廉，被广泛用于治疗人与动物的发热、疼痛、炎症、肌肉骨骼疾病以及与抗生素联合用药治疗呼吸道疾病。马术比赛中马匹需严格遵守用药规定，对参赛马匹进行兴奋剂是必须实施的工作之一。国际马术联合会公布的《2024国际马联兴奋剂禁用清单》中明确规定吲哚美辛、塞来昔布、噻洛芬酸等非甾体类抗炎药在马术比赛中属于禁用物质。马尿不同于运动员的尿液，其基质更为复杂，容易产生假阳性的现象，且药物在马匹体内的分布和代谢较为广泛，所以检测技术方面要求更为苛刻，需要更高的灵敏度。因此，如何降低马尿中复杂的基质背景干扰，建立一个能准确定性识别和高检测灵敏度定量分析马匹中非甾体类抗炎药违禁物质的检测方法至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种能够降低马尿中复杂的基质背景干扰，快速筛查和准确定性识别的马尿中非甾体类抗炎药的检测方法。

2、为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

3、一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、所述检测方法包括以下步骤：

5、步骤一、配制含有多种非甾体类抗炎药的标准品溶液以及待测马尿的样品溶液；

6、步骤二、获取标准品溶液以及样品溶液的色谱和质谱数据；其中，所述色谱和质谱数据是通过超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测得到，所述色谱数据包括保留时间，所述质谱数据包括母离子的精确质量数、子离子的精确质量数、定量离子与定性离子的相对离子丰度比、同位素峰相似度；

7、步骤三、利用标准品溶液的色谱和质谱数据构建数据库，将样品溶液与数据库进行匹配，对样品溶液进行定性。

8、所述步骤三中，若样品溶液与数据库中某一种非甾体类抗炎药同时满足以下匹配条件，则判定样品溶液中存在该种非甾体类抗炎药：

9、保留时间偏差为±2.5％；

10、母离子和子离子的精确质量数偏差均小于5×10-6；

11、定量离子与定性离子的相对离子丰度比偏差小于5％；

12、同位素峰相似度≥80％；

13、其中，所述定量离子与定性离子的相对离子丰度比的计算公式为：

14、

15、所述样品溶液的配制方法为：

16、取待测马尿1ml，置于15ml的离心管中，加乙酸乙酯4ml，混匀，超声5min，在4000r/min下离心5min，用乙酸乙酯重复提取3次，取全部上清液至新的离心管中,在40℃下氮吹挥干，加入1ml的体积分数为0.1％甲酸水溶液-乙腈(30:70，v/v)复溶，过0.22μm有机滤膜，得到样品溶液。

17、采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测时，

18、色谱条件为：

19、色谱柱：accucoretm c18柱，100mm*2.1mm，2.6μm；柱温：35℃；进样量：10μl；流速：0.3ml/min，流动相：a相为体积分数为0.1％甲酸水溶液，b相为乙腈；

20、质谱条件为：

21、使用电喷雾离子源以全扫描模式结合平行反应监测模式进行检测，其中，所述电喷雾离子源参数：正离子模式；鞘气流速为40arb，辅助气流速为10arb，喷雾电压为3.2kv，辅助气温度为350℃，离子传输管温度为320℃；全扫描模式参数：分辨率：70000fwhm；agc值：3e6；最大it:100ms；扫描范围：50至500m/z；平行反应检测模式参数：分辨率：17500fwhm；agc值：1e5；最大it:50ms；隔离窗口：1.5m/s；碰撞能量：20，40，60。

22、所述梯度洗脱程序为：

23、0-10min，30％b-40％b；10-13min，40％b-45％b；13-15min，45％b-90％b；15-21min，90％b；21-21.5min，90％b-30％b；21.5-25.0min，30％b。

24、所述检测方法还包括步骤四：

25、步骤四、以标准品溶液的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；根据标准曲线对样品溶液进行定量。

26、所述步骤四中，取多种非甾体类抗炎药的标准品置于容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释，制成1mg/ml的标准品储备液；用体积分数为0.1％甲酸水溶液-乙腈(30:70，v/v)溶液将标准品储备液逐级稀释为不同浓度梯度的标准品溶液。

27、所述非甾体类抗炎药包括甲灭酸、芬布芬、噻洛芬酸、托灭酸、依托度酸、奥沙普嗪、双氯芬酸、洛非考昔、美洛昔康、吲哚美辛、依托考昔、塞来昔布、阿西美辛、吲哚布洛芬、依尔替酸、酮洛芬、苯恶洛芬、地拉考昔、罗美昔布、舒洛芬。

28、所述酮洛芬的母离子(h+)为255.10139，子离子包括209.09798、194.07451、105.03490、177.05606；

29、所述芬布芬的母离子(h+)为255.10146，子离子包括237.09077、181.06456、191.08542、209.09595；

30、所述舒洛芬的母离子(h+)为261.05795，子离子包括110.99023、177.05443；

31、所述噻洛芬酸的母离子(h+)为261.05792，子离子包括105.03387、183.01097、215.05231；

32、所述吲哚布洛芬的母离子(h+)为282.11237，子离子包括236.10675、218.09624；

33、所述依托度酸的母离子(h+)为288.15918，子离子包括172.11362、270.14856、228.13814、210.12758、246.14871；

34、所述罗美昔布的母离子(h+)为294.06909，子离子包括212.08687、248.06345、228.05722、276.05826；

35、所述双氯芬酸的母离子(h+)为296.02411，子离子包括214.04936、250.01823、278.01315；

36、所述依尔替酸的母离子(h+)为301.98056，子离子包括221.00581、255.97464、283.96951、186.03716；

37、所述苯恶洛芬的母离子(h+)为302.05783，子离子包括256.05197、287.03387、270.03143；

38、所述洛非考昔的母离子(h+)为315.06854，子离子包括269.06274、297.05771、236.08360、218.07233、206.07251；

39、所述美洛昔康的母离子(h+)为352.04190，子离子包括115.03270、141.01163；

40、所述吲哚美辛的母离子(h+)为358.08408，子离子包括138.99454、174.09129；

41、所述塞来昔布的母离子(h+)为382.08310，子离子包括362.07657、332.07632；

42、所述地拉考昔的母离子(h+)为398.07809，子离子包括378.07132、283.06738；

43、所述阿西美辛的母离子(h+)为416.08960，子离子包括138.99454、312.07816、174.09128、260.09161；

44、所述奥沙普嗪的母离子(h+)为294.11227，子离子包括103.05462、276.10153、234.09113、206.09630；

45、所述甲灭酸的母离子(h+)为242.11720，子离子包括224.10680、209.08344；

46、所述托灭酸的母离子(h+)为262.06305，子离子包括244.05211、209.08334、229.02873；

47、所述依托考昔的母离子(h+)为359.06155，子离子包括280.07574、312.06555。

48、224.10680为甲灭酸的定量离子，209.08344为甲灭酸的定性离子；

49、237.09077为芬布芬的定量离子，181.06456、191.08542、209.09595为芬布芬的定性离子；

50、261.05792为噻洛芬酸的定量离子，105.03387、183.01097、215.05231为噻洛芬酸的定性离子；

51、244.05211为托灭酸的定量离子，209.08334、229.02873为托灭酸的定性离子；

52、172.11362为依托度酸的定量离子，270.14856、228.13814、210.12758、246.14871为依托度酸的定性离子；

53、294.11227为奥沙普嗪的定量离子，103.05462、276.10153、234.09113、206.09630为奥沙普嗪的定性离子；

54、214.04936为双氯芬酸的定量离子，250.01823、278.01315为双氯芬酸的定性离子；

55、269.06274为洛非考昔的定量离子，297.05771、236.08360、218.07233、206.07251为洛非考昔的定性离子；

56、115.03270为美洛昔康的定量离子，141.01163为美洛昔康的定性离子；

57、138.99454为吲哚美辛的定量离子，174.09129为吲哚美辛的定性离子；

58、359.06155为依托考昔的定量离子，280.07574、312.06555为依托考昔的定性离子；

59、382.08310为塞来昔布的定量离子，362.07657、332.07632为塞来昔布的定性离子；

60、138.99454为阿西美辛的定量离子，312.07816、174.09128、260.09161为阿西美辛的定性离子；

61、236.10675为吲哚布洛芬的定量离子，218.09624为吲哚布洛芬的定性离子；

62、221.00581为依尔替酸的定量离子，255.97464、283.96951、186.03716为依尔替酸芬的定性离子；

63、209.09798为酮洛芬的定量离子，194.07451、105.03490、177.05606为酮洛芬的定性离子；

64、302.05783为苯恶洛芬的定量离子，256.05197、287.03387、270.03143为苯恶洛芬的定性离子；

65、398.07809为地拉考昔的定量离子，378.07132、283.06738为地拉考昔的定性离子；

66、212.08687为罗美昔布的定量离子，248.06345、228.05722、276.05826为罗美昔布的定性离子；

67、261.05795为舒洛芬的定量离子，110.99023、177.05443为舒洛芬的定性离子。

68、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

69、1、本发明一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法，配制含有多种非甾体类抗炎药的标准品溶液以及待测马尿的样品溶液；获取标准品溶液以及样品溶液的色谱和质谱数据；利用标准品溶液的色谱和质谱数据构建数据库，将样品溶液与数据库进行匹配，对样品溶液进行定性；色谱和质谱数据是通过超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测得到，色谱数据包括保留时间，质谱数据包括母离子的精确质量数、子离子的精确质量数、定量离子与定性离子的相对离子丰度比、同位素峰相似度；本设计利用色谱保留时间、母离子的精确质量数、子离子的精确质量数、定量离子与定性离子的相对离子丰度比、同位素峰相似度共同对样品溶液进行定性，特别是子离子的精确质量数和相对离子丰度比具有特异性，可以更好的将基质背景中的杂质和目标物质区分，降低基质背景的干扰，减少假阳性的现象。因此，本发明能降低基质背景的干扰，减少假阳性的现象，对马尿中的目标物质进行准确定性。

70、2、本发明一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法，在配制样品溶液时，用乙酸乙酯作为提取溶剂，提取操作为超声5min后在4000r/min下离心5min，重复提取3次；此种样品前处理方式能降低基质效应，进一步降低基质背景的干扰。因此，本发明能够进一步降低基质背景的干扰。

71、3、本发明一种马尿中非甾体类抗炎药的检测方法，以标准品溶液的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，基于标准曲线对样品溶液进行定量分析；对20种非甾体类抗炎药的检测限≤0.145ng/ml，定量限≤1.45ng/ml，说明定量分析具有较高的检测灵敏度。因此，本发明的定量分析具有较高检测灵敏度。