一种胆汁酸亚型的检测方法

本技术涉及胆汁酸检测，具体涉及一种胆汁酸亚型的检测方法。

背景技术：

1、胆汁酸为胆汁的主要成分，是一组结构类似的类固醇酸的总称。在人的胆汁中，胆汁酸有游离型胆汁酸和结合型胆汁酸两大类。胆汁酸能够在肠道促进脂类消化吸收，同时还可以抑制胆汁中胆固醇结晶析出。胆汁酸主要在肝脏由胆固醇转化而来，具有广泛的生物学作用。

2、近年来研究发现胆汁酸对调节糖、脂代谢以及能量代谢具有重要作用，因此胆汁酸成分及含量的检测对于靶向代谢组学研究、了解疾病状态等都有重要意义。目前，常用的胆汁酸检测方法主要有酶循环法和高效液相色谱法，其中，酶循环法只能检测总胆汁酸含量，无法准确区分胆汁酸的不同分型。高效液相色谱法能够配合质谱分析能够对胆汁酸的类型进行定性鉴别，然而，在利用高效液相色谱法配合质谱分析中对胆汁酸亚型的检测效果并不理想，无法准确对胆汁酸亚型进行准确的定性研究。

3、因此，有必要提供一种能够对胆汁酸亚型进行高效检测的检测方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中高效液相色谱法对胆汁酸类型进行定性分析中存在无法准确对胆汁酸亚型进行准确定性的问题，本发明提供了一种胆汁酸亚型的检测方法。

2、本发明发明的方法不仅能够准确对胆汁酸亚型进行定性分析，同时还能够快速、准确对胆汁酸进行定量检测。

3、为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下。

4、一种胆汁酸亚型的检测方法，包括以下步骤：

5、将待检测溶液进行hplc-qtof串联质谱检测，得到待检样品的质谱信息，将得到的质谱信息利用sim模式分析，得到待检测溶液的前体离子值；将待检测溶液的前体离子值与多种胆汁酸标准品的质谱库进行比对，以确定待检测溶液中胆汁酸的种类；

6、将待检测溶液的前体离子值所对应的离子峰的峰面积代入到对应的胆汁酸标准品的浓度-峰面积线性关系曲线中进行计算，得到待检测溶液中对应胆汁酸的浓度；根据待检测溶液中对应胆汁酸的浓度得到胆汁酸含量。

7、所述胆汁酸含量的具体计算过程如下：

8、将待检测溶液中对应胆汁酸的浓度带入到胆汁酸含量计算公式中，得到待检测溶液中胆汁酸的含量，所述胆汁酸含量计算公式如下：

9、c＝x1/(b1/b2)；

10、式中，c为胆汁酸含量，x1为待检测溶液的胆汁酸的浓度，b1为添加内标的待检测溶液的前体离子值所对应的离子峰的峰面积，b2为添加内标空白样的前体离子值所对应的离子峰的峰面积。

11、本发明通过hplc高速分离，能够将胆汁酸进行有效分离，然后在通过qtof对胆汁酸经过hplc分离出的数据进行分析，将胆汁酸中的同分异构体有效分离出来，得到质谱信息，在根据sim模式对质谱信息进一步分析，从而对胆汁酸亚型进行准确的定性研究。

12、在一个优选的实施例中，所述多种胆汁酸标准品的质谱库的具体获得过程如下：

13、将多种胆汁酸标准品配置成系列标准溶液，然后分别进行hplc-qtof串联质谱检测，得到系列标准溶液的质谱信息；

14、将质谱信息利用sim模式分析，得到系列标准溶液的前体离子值，根据前体离子值筛选出多种胆汁酸标准品的前体离子值，根据多种胆汁酸标准品的前体离子值所对应的离子峰，得到多种胆汁酸标准品的定性离子峰，根据定性离子峰构建得到多种胆汁酸标准品的质谱库。

15、在一个优选的实施例中，所述多种胆汁酸标准品的前体离子值具体如下：

16、胆酸ca为407.2803；脱氧胆酸dca为391.2853；鹅脱氧胆酸cdca为391.2853；熊脱氧胆酸udca为391.2853；石胆酸lca为375.2904；甘氨胆酸gca为464.3017；甘氨脱氧胆酸gdca为448.3068；甘氨鹅脱氧胆酸gcdca为448.3068；甘氨熊脱氧胆酸gudca为448.3068；甘氨石胆酸glca为432.3119；牛磺胆酸tca为514.2844；牛磺脱氧胆酸tdca为498.2923；牛磺鹅脱氧胆酸tcdca为498.2923；牛磺熊脱氧胆酸tudca为498.2923；牛磺石胆酸tlca为482.2945。本发明能够得到不同种类胆汁酸更精确的前体离子值，相较与常规精确到小数点后两位的前体离子值，本发明中能够得到小数点后4位的前体离子值，进而提高了检测精准度。

17、在一个优选的实施例中，所述液相色谱条件具体如下：

18、流动相：流动相a为乙酸铵水溶液；流动相b为甲醇和乙腈；

19、进样体积：5μl；流速：0.2ml/min；柱温：40℃；

20、所述质谱条件具体如下：

21、离子化模式：esi-；雾化气流速:3.0l/min；接口温度：300℃；加热气流速：10.0l/min；dl温度：170℃；干燥气流速：10.0l/min；加热模块温度：400℃；碰撞气：氩气；扫描模式：选择性离子检测sim。

22、通过液相的梯度洗脱，根据保留时间不同，从而能够将同分异构体有效分离出来，在经过sim模式分析，从而得到胆汁酸中的各个成分的定性结果。

23、在一个优选的实施例中，所述乙酸铵水溶液的浓度为2～8mmol/l，甲醇和乙腈的体积比为1～2:1～2。

24、在一个优选的实施例中，所述胆汁酸标准品的标准曲线的具体获得方式如下：

25、将多种胆汁酸标准品的定性离子峰的峰面积与标准液浓度之间的对应关系，绘制得到多种胆汁酸标准品的标准曲线；

26、在一个优选的实施例中，所述标准液配置具体过如下：

27、将多种胆汁酸标准品分别溶于有机溶剂中，配置成标准储备液，将标准储备液用有机溶剂稀释后得到系列标准溶液。

28、在一个优选的实施例中，所述有机溶剂为甲醇；所述标准储备液的浓度为100mg/ml；所述甲醇的质量百分数为50～90％。

29、在一个优选的实施例中，所述待检测溶液检测前需要进行预处理，所述预处理的具体过程如下：

30、将待检溶液与乙腈和甲醇的混合液，离心取上清液，干燥，甲醇复溶后，得到预处理的待检样品。

31、在一个优选的实施例中，所述内标液为用乙腈稀释后的氘代化合物。通过内标液，能够用于校准因样品处理造成的不同胆汁酸的不同损失。

32、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

33、(1)本发明中对胆汁酸的检测方法，能够在20分钟左右完成对15种胆汁酸的检测，经过sim模式分析能够得到不同种类胆汁酸的精确前体离子值，从而能够对胆汁酸亚型进行准确的定性分析，进一步提高了对胆汁酸的检测效果，提高了对胆汁酸检测的精确度。

34、(2)本发明的检测方法能够有效、准确地区别出胆汁酸的分类，并根据sim模式分析得到的定性离子峰构建15种胆汁酸标准品的质谱库，通过质谱库能够对胆汁酸的分类进行快速比对，快速检测出不同的胆汁酸亚型，并通过标准曲线能够对胆汁酸进行定量分析。