兔出血症杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物，涉及一种兔出血症杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法

背景技术：

1、兔出血症(rabbit heamorrhagic disease，rhd)俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒(rabbit heamorrhagic disease virus，rhdv)感染兔并导致死亡的一种烈性病毒性传染病。本病一年四季均可发生，幼兔不易感，3月龄以上青年兔和成年兔最为易感，且发病率和死亡率最高。据报道，rhdv2病毒不同于rhdv1病毒，对幼兔及成年兔均易感，且致死率较高，目前该病防控无疫苗可用。兔巴氏杆菌(rabbit pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性细菌性传染病，是家兔的一种常见病和多发病，且发病迅速、死亡率高。兔瘟与巴氏杆菌病极易混合感染，是当前危害养兔业的主要混合感染传染病。

2、防控兔出血症和巴氏杆菌病主要采取疫苗免疫。现有兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(a型)三联灭活疫苗，其抗原组分为兔出血症1型vp60蛋白、多杀性巴氏杆菌以及产气荚膜梭菌。该疫苗无法防控rhdv2型引起的疾病。

技术实现思路

1、本技术以细胞无血清悬浮培养技术及细菌高密度发酵培养技术制备兔出血症1型抗原、兔出血症2型抗原、多杀性巴氏杆菌抗原，拓展了疫苗的防控疾病使用范围，研制兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗，有利于临床上防控兔出血症1型、兔出血症2型和兔巴氏杆菌在兔群中传播。

2、本发明所要解决的技术问题是：提供一种兔出血症1型杆状病毒载体、兔出血症2型杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病的二联三抗原组分灭活疫苗及其制备方法，该方法易于规模化放大，可实现疫苗生产过程中质量稳定可控，生物安全性好。该疫苗相较于现有疫苗在针对兔出血症2型的保护效力上有了提升，可实现一针免疫同时防控三种病原导致的疫病。

3、为解决上述技术问题，本发明提供一种兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗。

4、本发明的技术方案：

5、本发明提供的兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗包括抗原，所述抗原由灭活的重组兔出血症1型vp60杆状病毒、灭活的重组兔出血症2型vp60杆状病毒和灭活的兔多杀性巴氏杆菌组成。

6、所述二联灭活疫苗中的抗原成分为重组兔出血症1型vp60杆状病毒sf9细胞培养物、重组兔出血症2型vp60杆状病毒sf9细胞培养物和多杀性巴氏杆菌发酵菌液。

7、所述二联疫苗是由重组兔出血症1型vp60杆状病毒细胞培养物、重组兔出血症2型vp60杆状病毒细胞培养物和多杀性巴氏杆菌发酵菌液灭活后制备，

8、具体的，将重组兔出血症1型病毒vp60杆状病毒和重组兔出血症2型病毒vp60杆状病毒分别接种sf9昆虫细胞，于27～28℃培养至细胞病变80％以上时，分别收获培养物进行灭活，该灭活产物分别作为兔出血症1型抗原和兔出血症2型抗原；将兔源荚膜a群多杀性巴氏杆菌c3-1菌株扩增培养，加入灭活剂进行灭活，灭活后菌液作为巴氏杆菌抗原。

9、其中，抗原含量按照每毫升疫苗中含灭活前的重组兔出血症1型vp60杆状病毒血凝效价不低于1:256，重组兔出血症2型vp60杆状病毒血凝效价不低于1:256，兔多杀性巴氏杆菌菌数不低于7.0×109cfu进行配苗。

10、所述重组兔出血症1型vp60杆状病毒，名称为昆虫杆状病毒re-bacv-rhd1vp60-nj-n，于2022年10月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.45290；

11、重组兔出血症2型vp60杆状病毒，名称为昆虫杆状病毒re-bacv-rhd2vp60-c2，于2022年10月19日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.45289；

12、所述兔多杀性巴氏杆菌名称为多杀性巴氏杆菌zm-pm-a株，于2022年10月19日，保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.25935。

13、所述二联灭活疫苗还含有佐剂，所述佐剂为氢氧化铝胶，抗原与氢氧化铝胶佐剂的体积比例为7:1～9:1。

14、在本发明的一个实施方式中所述二联疫苗中，重组兔出血症1型vp60杆状病毒(兔出血症1型抗原)的体积百分含量为12.5％，重组兔出血症2型vp60杆状病毒(兔出血症2型抗原)的体积百分含量为12.5％，兔多杀性巴氏杆(巴氏杆菌抗原)的体积百分含量为56-60.8％，佐剂的体积百分含量为12.5％，余量为灭菌生理盐水。

15、所述疫苗可用于同时预防兔出血症1型、兔出血症2型、多杀性巴氏杆菌造成的疾病。

16、本发明还提供了所述兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

17、(1)兔出血症杆状病毒载体细胞培养物制备：将重组兔出血症1型vp60杆状病毒和兔出血症2型vp60杆状病毒分别接种sf9细胞进行培养，对收获的细胞培养物分别进行灭活；

18、(2)兔巴氏杆菌抗原灭活液制备：对多杀性巴氏杆菌进行发酵罐通气培养，对发酵菌液进行灭活；

19、(3)兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗的配制：抗原含量按照每毫升疫苗中含灭活前的兔出血症1型vp60蛋白血凝效价不低于1:256，兔出血症2型vp60蛋白血凝效价不低于1:256，兔多杀性巴氏杆菌菌数不低于7.0×109cfu进行配苗，加入佐剂后充分混匀。

20、所述方法中，步骤(1)中接种细胞为sf9细胞，接种密度为1.5～2.0x106个细胞/ml，所用培养基为昆虫细胞培养基，重组兔出血症vp60杆状病毒接种量为培养基总量的4％，培养条件温度为27～28℃、ph值为6.0～6.2、溶氧(do)50％～60％、搅拌转速为50～70r/min；当病变细胞达到80％以上即可收获细胞培养物。

21、步骤(1)中获得兔出血症1型和兔出血症2型杆状病毒载体细胞培养物，检测其血凝效价均不低于1:1024。

22、所述方法中，步骤(1)中使用甲醛对收获的细胞培养物进行灭活处理；灭活后的兔出血症1型杆状病毒载体细胞培养物灭活液和灭活后的兔出血症2型杆状病毒载体细胞培养物灭活液接种sf9细胞后无细胞病变，红细胞凝集试验测定无血凝性。

23、所述方法中，步骤(2)中，对多杀性巴氏杆菌进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将多杀性巴氏杆菌单菌落接种血琼脂斜面，37℃培养18h～22h，培养获得巴氏杆菌一级种子，将一级种子接种于含有血清的巴氏杆菌专用培养基，37℃培养18h～24h，获得二级多杀性巴氏杆菌种子，按照培养基量的1％～2％接种二级种子，同时加入0.5％～1％血清，搅拌转速为200～300r/min，ph值为7.2～7.6，通气培养，收获培养菌液；每毫升菌液含活菌数不低于1.0×1010cfu。

24、步骤(2)中采用甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理，并进行灭活检验，灭活后取样接种含有血琼脂平板和巴氏杆菌专用培养基进行培养，应无菌落生长。

25、本发明的有益效果：本发明涉及一种兔出血症(rhdv1型+rhdv2型)杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗有效成分包含重组杆状病毒bv-zmsd株表达的兔出血症1型vp60蛋白抗原，重组杆状病毒bv-zmcd株表达的兔出血症2型vp60蛋白抗原，灭活的多杀性巴氏杆菌c3-1株抗原。该二联灭活疫苗安全性好，免疫后能够产生针对兔出血症1型和兔出血症2型的抗体，抗体产生速度快，抗体水平高，持续时间长；对兔多杀性巴氏杆菌免疫攻毒保护率高。该疫苗可用于预防兔出血症1型、兔出血症2型、兔多杀性巴氏杆菌造成的疫病。