Anxa2蛋白和/或基因在筛选治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途

本技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及anxa2蛋白和/或基因在筛选治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。

背景技术：

1、膜联蛋白a2(annexin a2，anxa2)是在内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞和各种类型的癌细胞表面表达的膜联蛋白家族的重要成员。游离细胞质anxa2以36-kda蛋白的形式存在。anxa2有四种形式，分泌型、膜结合型、细胞质型和细胞核型。anxa2蛋白在体内可以作为单体、异二聚体或异四聚体存在。anxa2参与多种细胞功能，包括囊泡运输、细胞分裂、钙信号传导和细胞生长。anxa2的许多功能受多种翻译后修饰的调节。近年来，anxa2已被证明在癌症中起重要作用，并且它促进与肿瘤进展相关的许多过程，如肿瘤增殖、迁移、上皮间质转化(emt)、侵袭、干细胞形成和对治疗(如放疗、化疗和免疫疗法)的抗性。

2、目前，癌症转移和耐药性仍然缺乏有效治疗策略，因此寻找有效的生物标志物尤为重要。anxa2在大多数组织中表现出高表达水平，在一些肿瘤及其微环境中其表达水平甚至更高。anxa2是多种因素的重要调节因子，可能是对抗耐药癌症的靶点。

3、因此评估anxa2作为癌症细胞转移的治疗靶点和在肿瘤转移中对化疗药物的耐药性的潜在效果具有重要意义。

技术实现思路

1、本技术利用crispr/cas9基因组编辑技术，敲除anxa2基因，用于研究anxa2作为肿瘤转移的治疗靶点和在肿瘤转移中对化疗药物的耐药性的潜在效果。具体的，

2、本发明的第一方面，涉及anxa2蛋白和/或基因在筛选治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途，所述的药物降低anxa2蛋白的活性、降低anxa2蛋白的浓度和/或降低anxa2基因的表达。

3、优选的，所述的药物通过基因改造降低anxa2基因的表达。

4、优选的，所述的基因改造包括基因敲除或沉默。

5、优选的，所述的的基因改造方法包括使用crispr/cas、锌指核酸酶、大范围核酸酶技术或talens技术。

6、优选的，所述的基因改造位点位于非人动物anxa2的1号外显子处。

7、优选的，所述的基因改造位点位于ncbi登录号为nc_000075.7的核苷酸序列的第69374314-69374813位。

8、优选的，所述的基因改造位点序列为seq id no：12。

9、优选的，所述的基因改造方法包括使用sgrna。

10、优选的，所述的sgrna 3′末端包含pam序列，进一步优选的，所述的pam序列可以为agg、tgg或ggg。

11、优选的，所述的sgrna序列包括在5’端添加鸟嘌呤(g)。

12、优选的，所述的sgrna合成引物序列包括5’-cacc(seq id no：9)-3’或5’-aaac(seq id no：10)-3’。

13、优选的，所述的sgrna合成引物序列包括：

14、sgrna1-f：caccgacaccaacttcgatgctgag(seq id no：1)，

15、sgrna1-r：aaacctcagcatcgaagttggtgtc(seq id no：2)，

16、sgrna2-f：caccacacccccaagtgcctac(seq id no：3)，

17、sgrna2-r：aaacgtaggcacttgggggtgt(seq id no：4)，或者，

18、sgrna3-f：aaacacaccaacttcgatgctgaga(seq id no：5)，

19、sgrna3-r：cacctctcagcatcgaagttggtgt(seq id no：6)。

20、优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，更优选的，本发明所述的非人动物选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑的非人动物。

21、进一步优选的所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

22、在本发明的一个具体实施方式中，所述的筛选方法包括将靶向anxa2基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得转基因非人动物。

23、优选的，所述的药物包括抑制肿瘤的转移和/或降低对化疗药物的耐药性。

24、本发明的第二方面，涉及一种靶向anxa2基因的sgrna，所述的sgrna靶向anxa2基因的1号外显子。

25、优选的，所述的sgrna靶位点序列包括seq id no：11所示的核苷酸序列。

26、优选的，所述的sgrna 3′末端包含pam序列，进一步优选的，所述的pam序列可以为agg、tgg或ggg。

27、优选的，所述的sgrna序列包括在5’端添加鸟嘌呤(g)。

28、优选的，所述的sgrna合成引物序列包括5’-cacc(seq id no：9)-3’或5’-aaac(seq id no：10)-3’。

29、优选的，所述的sgrna合成引物序列包括：

30、sgrna1-f：caccgacaccaacttcgatgctgag(seq id no：1)，

31、sgrna1-r：aaacctcagcatcgaagttggtgtc(seq id no：2)，

32、sgrna2-f：caccacacccccaagtgcctac(seq id no：3)，

33、sgrna2-r：aaacgtaggcacttgggggtgt(seq id no：4)，或者，

34、sgrna3-f：aaacacaccaacttcgatgctgaga(seq id no：5)，

35、sgrna3-r：cacctctcagcatcgaagttggtgt(seq id no：6)。

36、本发明的第三方面，涉及一种生物材料，

37、所述生物材料包括：

38、(a)一种dna分子，所述dna分子编码上述任一所述sgrna；

39、(b)一种载体，所述载体包含上述任一所述sgrna或(a)所述的dna分子；

40、(c)一种细胞，所述细胞包含(b)所述的载体。

41、优选的，所述的载体为病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。

42、本发明的第四方面，涉及一种包含上述靶向anxa2基因的sgrna，上述的生物材料在anxa2基因修饰中的应用。

43、本发明的第五方面，涉及上述的sgrna、上述的生物材料在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

44、优选的，所述的药物包括抑制肿瘤的转移或降低对化疗药物的耐药性。

45、本发明的第六方面，涉及一种治疗和/或预防肿瘤药物的筛选方法，所述筛选方法包括构建肿瘤疾病模型，将候选药物施予所述肿瘤疾病模型，评估候选药物对anxa2蛋白的活性、anxa2蛋白的浓度和/或anxa2基因的影响。

46、优选的，所述的肿瘤疾病模型包括皮下肿瘤模型或原位肿瘤模型。

47、优选的，所述候选药物降低anxa2蛋白的活性、降低anxa2蛋白的浓度和/或降低anxa2基因的表达。

48、优选的，所述候选药物抑制肿瘤的转移和/或降低对化疗药物的耐药性。

49、本发明的第七方面，涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的用途中限定的药物、上述的sgrna、上述的生物材料，或上述的筛选方法筛选出的候选药物。

50、本发明所述的“肿瘤”包括恶性肿瘤，优选的，所述恶性肿瘤包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

51、本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

52、本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度。

53、在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述非人动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠或大鼠。

54、在一个特定实施方式中，所述非人动物是小鼠，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。

55、除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，apractical guideto molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson andm.simon，eds.-in-chief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and155(wuetal.eds.)and vol.185，″gene expression technology″(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller andm.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods incell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratorypress，cold spring harbor，n.y.，1986)。

56、本发明的技术效果在于

57、1、anxa2是一种重要的膜蛋白，之前的研究仅仅是停留在理论上，本发明明确anxa2蛋白或基因可以作为肿瘤或其转移的药物靶点，通过评估候选药物对该药物靶点的作用，从而获得能治疗和/或预防肿瘤或其转移的药物；

58、2、应用crispr/cas9基因重组系统进行anxa2基因的敲除，其敲除效率高，所述sgrna通过靶向anxa2基因达到恶性肿瘤转移的治疗效果。

59、以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

60、本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。