一种分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法。

背景技术：

1、近年来，随着蛋白质工程技术的发展，将野生型卡拉胶酶进行分子改造，以期提高卡拉胶酶的热稳定性、酶活力等酶学性质，扩大卡拉胶酶的应用范围，推动卡拉胶的高值化利用。

2、蛋白质的结构往往决定其功能，常用的电子显微镜在解析结构方面发挥重要的作用，但却不能满足解析分子随时间所产生的构象改变的需求。传统的电子显微镜通常只需要在真空或干燥条件下进行观测，因此，不能观察分子的动态变化。液相电镜(liquid-phase electron microscopy)与其他观测结构的电镜的主要不同之处在于它能够在液体环境中对样品进行观测，这也使得液相电镜能够更好地模拟生物体内的真实环境，观察生物分子在溶液中的结构和动态行为。此外，液相电镜还可以实现原位观察，即在样品受到外部刺激或条件变化时，也能够实时观察样品的响应和变化。总的来说，液相电镜在观测样品时更接近生物体内的真实环境，能够提供更多关于生物分子结构和行为的信息。

3、液相电镜在测试过程中对样品稳定性、分辨率和对比度有着更高的要求。首先，液相电镜需要在液体环境中对样品进行观测，这对样品的稳定性、样品准备和操作等方面提出了更高的要求。蛋白质在液相电镜中可能会受到损伤或失活，因为蛋白质对温度、ph值等条件更为敏感。再者，液相电镜的分辨率和对比度通常较低，这对于观察生物分子的细微结构可能不够精细，尤其是生物领域通常需要更高分辨率的电镜来观察蛋白质的生物结构。最后，在液相电镜中，样品的准备和操作相对复杂，需要特殊的技术和设备。对于生物样品，特别是活体生物样品，样品的处理和操作更加困难，可能导致样品的失活或变性。

4、为此，分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方式有待改进。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法，该方法利用稳定性更高的突变体并设计了观测体系与条件，能够揭示蛋白质的结构与功能关系、研究蛋白质的动态行为，为液相电镜在蛋白质观察领域的应用提供理论依据。

2、为此，在本发明的实施例中，提供了一种分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法，其包括以下步骤：

3、s1、利用hole分析野生型κ-卡拉胶酶与突变体n205c-g239c的底物通道的变化；

4、s2、利用jem-1400flash透射电子显微镜在100kev的电子能量和的剂量率下，观察野生型κ-卡拉胶酶和突变体n205c-g239c在含有底物κ-新卡拉胶四糖的环境中的反应；其中样品以0.1秒的曝光时间拍照，使用imagej对图像进行处理和分析。

5、根据本发明的实施例，利用hole分析野生型κ-卡拉胶酶与突变体n205c-g239c的底物通道的变化，可得到蛋白质底物通道的大小，证明突变使蛋白质底物通道变大；利用jem-1400flash透射电子显微镜在100kev的电子能量和的剂量率下观察，可观察到蛋白质催化隧道开放的过程，并且利用稳定性提高的突变体作为合适的观察材料，保证蛋白质在观察过程中不会失活，如此可分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为，在实现原位观察的前提下，不仅有助于揭示蛋白质的结构与功能关系、研究蛋白质的动态行为，成功观测到蛋白质的运动可以拓展液相电镜的应用领域，以便于对特定目的酶进行理性改造。

6、可选地，步骤s2包括：

7、将κ-卡拉胶酶与κ-新卡拉四糖底物混合成待测蛋白质液体；

8、将所述待测蛋白质液体滴在含有石墨烯支持膜的金载网上，经刻蚀，倒扣在装有hplc级水的烧杯中，制成微芯片样品；

9、将微芯片样品置于jem-1400flash透射电子显微镜中观察。

10、可选地，所述突变体n205c-g239c的氨基酸序列如seq id no.1所示。

11、可选地，步骤s1中，野生型κ-卡拉胶酶底物通道的最小和最大直径分别为0.73nm和0.90nm，突变体n205c-g239c的底物通道的最小和最大直径分别为0.75nm和1.29nm。

12、可选地，步骤s2中，观察到蛋白质催化隧道开放的过程。

13、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种分析κ-卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2包括：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变体n205c-g239c的氨基酸序列如seqid no.1所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，野生型κ-卡拉胶酶底物通道的最小和最大直径分别为0.73nm和0.90nm，突变体n205c-g239c的底物通道的最小和最大直径分别为0.75nm和1.29nm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，观察到蛋白质催化隧道开放的过程。

技术总结本发明提供了一种分析κ‑卡拉胶酶的结构和在溶液中动态行为的方法，该方法利用Ho le分析野生型κ‑卡拉胶酶与突变体N205C‑G239C的底物通道的变化；利用JEM‑1400Flash透射电子显微镜在100keV的电子能量和的剂量率下，观察野生型κ‑卡拉胶酶和突变体N205C‑G239C在含有底物κ‑新卡拉胶四糖的环境中的反应；其中样品以0.1秒的曝光时间拍照，使用ImageJ对图像进行处理和分析。该方法利用稳定性更高的突变体并设计了观测体系与条件，能够揭示蛋白质的结构与功能关系、研究蛋白质的动态行为，为液相电镜在蛋白质观察领域的应用提供理论依据。技术研发人员：朱艳冰,吴婷,倪辉,姜泽东,李利君,陈艳红,郑明静,李志朋,洪涛,杜希萍受保护的技术使用者：集美大学技术研发日：技术公布日：2024/8/5