细胞冻存保护液和细胞冻存方法与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种细胞冻存保护液和细胞冻存方法。

背景技术：

1、细胞冻存和复苏是脐带血造血干细胞应用中的关键环节，直接影响细胞冷冻保存后的活率和功能，决定了细胞冻存复苏后进行科学研究或临床应用的效果。

2、目前，细胞冻存复苏依旧遵循“慢冻快融”的基本原则。研究人员使用添加多种冻存保护剂的冻存液，以降低冰点、增加细胞渗透压稳定性和减少细胞应激损伤，实现在冻存复苏过程中保护细胞的目的。但由于细胞冻存液所含成分不同，其冻存效果也存在一定差异，临床应用受限情况也不同，因此筛选出适用于脐带血造血干细胞的冻存保护液，对造血干细胞的临床应用至关重要。

3、二甲基亚砜(dmso)是常用的细胞冻存保护剂，也是迄今为止上市的细胞治疗产品所应用的冻存保护液中所含有的主要有效成分。dmso作为一种重要的渗透型细胞保护剂可以减少降温过程中细胞内外冰晶的形成从而减少机械损伤，但其具有的细胞毒性也会影响细胞活性，同时含有dmso的冻存保护液输注给患者后也会带来一些并发症，如恶心呕吐、腹泻、神经系统症状、心脏毒性等等。

4、因此市面上针对低含量或无dmso的冻存液的在售或在研产品众多，其中人血白蛋白(human serum albumin，hsa)作为目前常用的冻存保护剂，起到在冻存复苏过程中保护细胞，维持细胞状态的作用。然而细胞产品在临床应用中，不经清洗直接回输，hsa(血液制品)同样对患者有导致过敏等不良反应的风险。且hsa存在批间差异，供货周期长或不稳定等因素。因此，改进的低含量dmso的冻存试剂是目前市场需要的。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供细胞冻存保护液，以改进现有的低含量dmso冻存试剂的缺陷。

2、本发明的第二目的在于提供罗汉果皂苷ⅴ在制备细胞冻存试剂中的应用。

3、本发明的第三目的在于提供一种细胞冻存方法。

4、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

5、第一方面，提供了一种细胞冻存保护液，该细胞冻存保护液含有2～5％v/v二甲基亚砜和10～50μm罗汉果皂苷ⅴ。

6、可选的实施方式中，该细胞冻存保护液含有5％v/v二甲基亚砜。

7、可选的实施方式中，该细胞冻存保护液含有50μm罗汉果皂苷ⅴ。

8、可选的实施方式中，所述细胞冻存保护液的基质包括pbs、血清、生理盐水、复方电解质注射液、复方电解质注射液(ⅱ)和细胞培养基中的一种或多种。

9、可选的实施方式中，该细胞冻存保护液的基质为复方电解质注射液。

10、可选的实施方式中，所述细胞冻存保护液含有5％v/v二甲基亚砜和50μm罗汉果皂苷ⅴ。

11、第二方面，还提供了罗汉果皂苷ⅴ在制备细胞冻存试剂中的应用。

12、可选的实施方式中，所述罗汉果皂苷ⅴ在所述细胞冻存试剂中的工作浓度为10～50μm。

13、第三方面，还提供了一种细胞冻存方法，该细胞冻存方法包括使用第一方面的细胞冻存保护液冻存细胞。

14、可选的实施方式中，冻存的细胞包括造血干细胞或nk细胞。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、本发明提供的细胞冻存保护液其中含有2～5％v/v二甲基亚砜(dmso)和10～50μm罗汉果皂苷ⅴ，其具有如下优势：

17、(1)所用dmso含量不超过5％v/v，临床应用过程中可减少dmso引发的副作用。

18、(2)其中添加罗汉果皂苷ⅴ替代人血白蛋白(human serum albumin,hsa)，避免了人血白蛋白导致的批间差异大、货期不稳定的影响，同时避免其可能造成的过敏等炎症反应。

19、(3)其中添加的罗汉果皂苷ⅴ达到了保护细胞，提升活率，减少细胞凋亡的作用，并且其在临床上有抗癌和抗糖尿病等作用，适用于后续临床应用。

20、(4)与经典10％ dmso冻存保护液效果一致。

21、综上，本发明通过减少细胞冻存保护液中dmso含量，并通过添加罗汉果皂苷ⅴ达到了与经典10％v/v dmso冻存保护液相同的冻存效果，同时还减少了后续应用中dmso可能造成的影响。并且避免了添加人血白蛋白可能导致的过敏反应，以及人血白蛋白商品的供货周期等影响。本发明通过罗汉果皂苷ⅴ的新用途，提供了一种降低dmso含量的细胞冻存保护液及冻存复苏方法，实现了冻存保护造血干细胞的目的，为临床应用提供更多参考价值。

技术特征：

1.一种细胞冻存保护液，其特征在于，含有2～5％v/v二甲基亚砜和10～50μm罗汉果皂苷ⅴ。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存保护液，其特征在于，含有5％v/v二甲基亚砜。

3.根据权利要求1所述的细胞冻存保护液，其特征在于，含有50μm罗汉果皂苷ⅴ。

4.根据权利要求1～3任一项所述的细胞冻存保护液，其特征在于，所述细胞冻存保护液的基质包括pbs、血清、生理盐水、复方电解质注射液、复方电解质注射液(ⅱ)和细胞培养基中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的细胞冻存保护液，其特征在于，所述基质为复方电解质注射液。

6.根据权利要求5所述的细胞冻存保护液，其特征在于，所述细胞冻存保护液含有5％v/v二甲基亚砜和50μm罗汉果皂苷ⅴ。

7.罗汉果皂苷ⅴ在制备细胞冻存试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述罗汉果皂苷ⅴ在所述细胞冻存试剂中的工作浓度为10～50μm。

9.一种细胞冻存方法，其特征在于，包括使用权利要求1～5任一项所述的细胞冻存保护液冻存细胞。

10.根据权利要求9所述的细胞冻存方法，其特征在于，冻存的细胞包括造血干细胞或nk细胞。

技术总结本发明提供了一种细胞冻存保护液和细胞冻存方法，涉及生物技术领域。该细胞冻存保护液有2～5％v/v二甲基亚砜和10～50μM罗汉果皂苷Ⅴ。该细胞冻存保护液通过添加罗汉果皂苷Ⅴ达成降低DMSO含量，同时保护细胞状态，在细胞复苏后维持良好的细胞活率及干性功能，为后续细胞研究及细胞产品应用提供重要参考价值。技术研发人员：张宇,赵云艳,杜为,李光昭,刘容志受保护的技术使用者：协和干细胞基因工程有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/5