与宜章红壳麦抗条锈病基因QYr.YZHK-2BL连锁的KASP分子标记、引物组合及应用

本发明属于小麦基因检测，具体涉及一种与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记、引物组合及应用。

背景技术：

1、小麦是世界三大粮食作物之一，在我国种植面积和产量仅次于玉米、水稻。小麦条锈病是由小麦条锈菌[ puccinia striiformis f. sp.  tritici, ( pst)]引起的气传性专性寄生病害。条锈菌孢子体积微小且重量极轻，可随气流传播数千里，传播速度快，危害范围广，且在小麦全生育期均可发病，危害周期较长。目前，已正式命名的抗条锈基因包括86个（yr1~yr86）。但新的毒性生理小种的更替频繁，许多主栽品种抗锈性“丧失”，生产上可利用的有限，且多以全生育期抗性为主，所以仍需要不断挖掘小麦资源，尤其是地方品种。

2、随着生物学和遗传学的发展，分子标记技术逐渐成为研究遗传变异、遗传图谱构建、物种鉴定和基因定位的重要手段。尤其在作物育种、种质资源保护和遗传多样性分析中，分子标记技术发挥着越来越重要的作用。然而，传统分子标记检测通量低，效率低下，无法实现大规模筛选。近年来，随着基因芯片和高通量测序技术的发展，基于生物个体间基因组序列单碱基多态性(single nucleotide polymorphism,snp)标记被成功开发。以snp为基础的第三代kasp(kompetitive allele specific pcr)分子标记相较于传统的分子标记技术，具有诸多优势；首先，其准确性高，能够有效区分不同的等位基因。其次，kasp标记技术具有高通量特点，能够同时检测多个snp位点，提高了检测效率。此外，kasp标记技术还具有成本低、操作简便等优点，使得其在大规模遗传分析和种质资源鉴定中具有广泛的应用前景。

3、宜章红壳麦是宜章县一种具有独特品质的红皮小麦；通过qtl定位的方法从宜章红壳麦中鉴定到一个抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl，位于2b染色体长臂上的162.5~167cm区间。但是，目前尚未有关于qyr.yzhk-2bl紧密连锁kasp分子标记的报道，无法实现对该抗病位点进行快速、高效的选择，极大的限制该抗性位点在小麦抗病育种中的利用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记、引物组合及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记，所述分子标记是利用抗条锈病基因位点qyr.yzhk-2bl两翼snp探针开发两对kasp特异连锁标记，探针为核苷酸序列如seq id no.1的探针序列ax-109390870和核苷酸序列如seq id no.2所示的探针序列ax-109964436；

4、所述连锁标记为kasp-ax-109390870的kasp标记和kasp-ax-109964436的kasp标记。

5、本发明根据小麦15k snp芯片数据，利用qtl icimapping 4.2软件构建遗传图谱。结合群体的抗病表型数据，定位抗条锈病qtl位点，在2b染色体长臂上的162.5~167cm区间定位出在所有检测环境均稳定表达的主效抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl，对获得的多态性snp位点进行分子标记的开发，最终得到两对kasp分子标记的包括kasp-ax-109390870和kasp-ax-109964436与抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl紧密连锁。

6、一种与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记的引物组合，所述引物组合为kasp-ax-109390870引物组和kasp-ax-109964436引物组；

7、所述kasp-ax-109390870引物组包括核苷酸序列如seq id no.3所示的kasp-ax-109390870f1、核苷酸序列如seq id no.4所示的kasp-ax-109390870f2和核苷酸序列如seqid no.5所示的kasp-ax-109390870c；

8、所述kasp-ax-109964436引物组包括核苷酸序列如seq id no.8所示的kasp-ax-109964436f1、核苷酸序列如seq id no.9所示的kasp-ax-109964436f2和核苷酸序列如seqid no.10所示的kasp-ax-109964436c。

9、进一步地，所述kasp-ax-109390870f1的5'端添加有fam荧光标签序列，所述kasp-ax-109390870f2的5'端添加有hex荧光标签序列；所述kasp-ax-109964436f1的5'端添加有fam荧光标签序列，所述kasp-ax-109964436f2的5'端添加有hex荧光标签序列。

10、本发明还提供了一种筛选或鉴定含有抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl的小麦品种的方法，包括：以待测植株样品的基因组dna作为模板，采用所述的引物组合进行荧光定量pcr扩增，根据pcr扩增结果对待测小麦进行基因分型。

11、进一步地，10μl总体积中，5μl的2×master mix，0.04μl上游引物fam，0.04μl上游引物hex，0.08μl通用引物com，4μl dna模板，补充超纯水至10μl。

12、进一步地，94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，10个循环，每个循降退火延伸低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环，并在30℃读取荧光信号30s。

13、本发明开发了一种与抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl紧密连锁的kasp分子标记kasp-ax-109390870和kasp-ax-109964436，不仅可以高效、准确检测含抗条锈病位点qyr.yzhk-2bl的小麦株系，还可用该标记进行高通量的分子标记辅助选择，有效提高育种效率，服务于小麦抗病分子育种；在抗条锈病基因的分子标记辅助选择育种中具有重要实践意义。

技术特征：

1.一种与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记，其特征在于：所述分子标记是利用抗条锈病基因位点qyr.yzhk-2bl两翼snp探针开发两对kasp特异连锁标记，探针为核苷酸序列如seq id no.1的探针序列ax-109390870和核苷酸序列如seq idno.2所示的探针序列ax-109964436；

2.一种根据权利要求1所述的与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记的引物组合，其特征在于：所述引物组合为kasp-ax-109390870引物组和kasp-ax-109964436引物组；

3.根据权利要求2所述的与宜章红壳麦抗条锈病基因qyr.yzhk-2bl连锁的kasp分子标记的引物组合，其特征在于，所述kasp-ax-109390870f1的5'端添加有fam荧光标签序列，所述kasp-ax-109390870f2的5'端添加有hex荧光标签序列；所述kasp-ax-109964436f1的5'端添加有fam荧光标签序列，所述kasp-ax-109964436f2的5'端添加有hex荧光标签序列。

4.根据权利要求1所述的分子标记或根据经权利要求2或3所述的引物组合在筛选或鉴定高抗条锈病的小麦品种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括：以待测植株样品的基因组dna作为模板，采用权利要求2或3所述的引物组合进行荧光定量pcr扩增，根据pcr扩增结果对待测小麦进行基因分型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述荧光定量pcr的反应体系：10μl总体积中，5μl 2×master mix，0.04μl上游引物fam，0.04μl上游引物hex，0.08μl通用引物com，4μl dna模板，补充超纯水至10μl。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述荧光定量pcr的反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，10个循环，每个循降退火延伸低0.6℃；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环，并在30℃读取荧光信号30s。

技术总结本发明属于小麦基因检测技术领域，公开了一种与宜章红壳麦抗条锈病基因QYr.YZHK‑2BL连锁的KASP分子标记、引物组合及应用，所述分子标记是利用抗条锈病基因位点QYr.YZHK‑2BL两翼SNP探针开发两对KASP特异连锁标记，探针为核苷酸序列如SEQ ID NO.1的探针序列AX‑109390870和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的探针序列AX‑109964436；所述连锁标记为KASP‑AX‑109390870的KASP标记和KASP‑AX‑109964436的KASP标记。本发明提供的标记可用来检测宜章红壳麦2B染色体上的抗条锈病位点QYr.YZHK‑2BL，快速筛选、准确的鉴定目标材料是否含有该基因位点，进而提高小麦抗病育种效率。技术研发人员：杨武云,李玉梅,万洪深,李俊,刘泽厚,杨佳茹,杨宁,唐豪受保护的技术使用者：四川省农业科学院作物研究所（四川省种质资源中心）技术研发日：技术公布日：2024/8/5