一组与肺腺癌相关的特异性甲基化诊断标志物及其应用

本发明涉及生物诊断试剂，尤其涉及一组与肺腺癌相关的特异性甲基化诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、据最新国际癌症机构估计，2020年肺癌的新发病例约220万，约占每年癌症新发病例的11.4％；而死亡例数约为180万，占比18％，其发病率和死亡率在世界范围内分别排名第二和第一。据国家癌症中心发布的《2016年中国癌症统计数据》表明我国肺癌近二十年间的发病率呈逐年上升趋势；2016年我国肺癌的发病率和死亡率均排在首位，新发病例约为82.8万人，死亡人数约为65.7万人。此外，我国肺癌的发病率在不同性别、不同年龄段及不同地区间差距悬殊，近年来尤其以女性、45岁以上人群及城市地区患者增长为主。除年龄外，目前已经明确多项肺癌相关的高危因素，如吸烟、空气污染、二氧化硅等职业暴露、既往肺部疾病史(慢阻肺和肺纤维化等)及肺癌家族史等，但影响肺癌发生的因素众多，其发病机制仍有待挖掘。其中肺腺癌是肺癌最常见的亚型，约占所有肺癌的60％，且呈明显的上升趋势。可以预计，肺腺癌的发病率在未来仍将持续升高，是威胁我国居民健康的严重挑战之一。

2、及时准确的诊断是肺腺癌治疗的前提，是降低肺腺癌死亡率的最有效方法之一。常用的组织活检方法包括在ct或彩超引导下经皮肺穿刺活检、支气管镜检查等，除了有创性及潜在的并发症，组织样本具有一定的肿瘤异质性，会影响诊断的准确性，且在早期癌症或术后残留及癌症复发患者中难以施展。目前，胸部低剂量计算机断层扫描(ldct)是公认的肺癌筛查方式。多项随机对照研究结果表明ldct筛查能够通过提高早期肺癌的检出而降低肺癌的总体死亡率，但由于ldct具有较高的敏感性，其在临床试验中的假阳性率高达23.3％。这提示基于影像学对肺部结节病灶良恶性的综合判断与病灶的实际情况存在一定的偏差，其准确性仍有待提高。且出于对假阳性成像结果及辐射暴露的担心，ct筛查在高危人群实践中依从性仍有待提高。痰液的脱落细胞学检查或肺泡灌洗液上皮细胞中核酸类分子的检测(rna、dna和microrna)简便易行，可进行多次检测，但在早期肺癌中的灵敏度不高，仍需进一步研究以确定其临床有效性和实用性。

3、近年来，多项研究开始探索血浆游离cfdna甲基化标志物在肺癌/非小细胞肺癌/肺腺癌中的诊断效果，提示cfdna甲基化标志物作为肺腺癌筛选和早期诊断标志物的潜在价值。早期研究多关注于单个基因的甲基化水平在肺癌cfdna中的诊断效果(如shox2，sept9及dclk1等)，灵敏度在44.3％-60％不等。随后，更多的研究从全基因组甲基化数据出发筛选甲基化标志物。2017年，ooki a等人基于tcga肺癌组织和癌旁组织450k芯片数据筛选得到6个甲基化标志物(cdo1,hoxa9,ajap1,ptgdr,uncx和march11)，该6个标志物在cfdna(n＝85)中联合诊断早期非小细胞肺癌的灵敏度和特异度分别为72.1％和71.4％。2017年，hulberta等人同样基于tcga肺癌组织和癌旁样本确定了不完全重合的6个甲基化标志物(sox17和tac1等)，在非小细胞肺癌cfdna(n＝210)中的灵敏度和特异度的范围分别为65-76％和74-84％。2021年，liangn等人同样基于tcga组织数据确定了一组泛癌标志物，在ⅰ-ⅲ期肺癌患者cfdna中的灵敏度为52-81％。我们注意到上述研究在确定甲基化标志物时仅用肺癌组织/血浆和癌旁组织/健康对照cfdna进行分析筛选出两组之间差异最大的标志物，或者是泛癌标志物及一些已知的抑癌基因进行后续无创诊断，而没有考虑到标志物的肿瘤特异性的特点。此外，也有一些研究在探索癌症标志物的时候将不同细胞或癌症类型具有特异性甲基化图谱考虑在内。但在肺癌早期患者中灵敏度有限(21.9％(14.8-31.1％))。目前cfdna甲基化检测以全基因组甲基化检测、靶向硫化测序等高通量测序和低通量检测为主。上述高通量测序无疑加速了标志物的开发，但为满足上样量需要采集更多的血液，这可能会降低参与者的依从性，复杂的技术设备和较高的成本价格均限制其在大样本人群中的推广。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中高通量测序为了满足上样量需要采集更多的血液，这可能会降低参与者的依从性，复杂的技术设备和较高的成本价格均限制其在大样本人群中的推广。

2、本发明的目的是为了解决现有技术中缺少一组肺腺癌特异性的甲基化标志物的筛选流程和初步验证。

3、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

4、一种肺腺癌诊断标志物，包括cg24996482(na)、cg07077277(hist1h2aa)、cg05148722(hist1h2bf)、cg00608169(na)、cg15435730(tfap2d)、cg21174344(na)、cg15803869(na)、cg23943136(gata3)、cg03933026(na)、cg27630311(tbx3)、cg08448665(c21orf88)及cg17900854(c21orf88)中的至少一种。

5、本技术还提供了cpg位点作为肺腺癌组织特异性甲基化标志物在制备肺腺癌诊断产品中的应用，所述cpg位点为cg24996482(na)、cg07077277(hist1h2aa)、cg05148722(hist1h2bf)、cg00608169(na)、cg15435730(tfap2d)、cg21174344(na)、cg15803869(na)、cg23943136(gata3)、cg03933026(na)、cg27630311(tbx3)、cg08448665(c21orf88)及cg17900854(c21orf88)中的至少一种。

6、优选的，所述cpg位点为cg07077277(hist1h2aa),cg08448665(c21orf88),cg15435730(tfap2d),cg17900854(c21orf88),cg27630311(tbx3)及cg03933026(na)6个cpg位点的组合。

7、优选的，所述肺腺癌诊断产品为试剂或试剂盒。

8、本技术还提供了一种肺腺癌诊断产品，包括cg24996482(na)、cg07077277(hist1h2aa)、cg05148722(hist1h2bf)、cg00608169(na)、cg15435730(tfap2d)、cg21174344(na)、cg15803869(na)、cg23943136(gata3)、cg03933026(na)、cg27630311(tbx3)、cg08448665(c21orf88)及cg17900854(c21orf88)中的至少一种。

9、优选的，还包括医学上可接受的其他试剂。

10、优选的，所述所述产品中包括cg07077277(hist1h2aa),cg08448665(c21orf88),cg15435730(tfap2d),cg17900854(c21orf88),cg27630311(tbx3)及cg03933026(na)。

11、综上所述，本技术中通过具体的验证实验证明了上述提供的12个肺腺癌特异性cpg位点在早期肺腺癌患者中即出现异常改变，并且相比于肺鳞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌等呈现出肺腺癌特异性甲基化改变，在tcga肺腺癌数据中评价该12个cpg位点的诊断效果，其auc范围在0.652-0.911之间，灵敏度在54.9-83.1％之间，而特异度在81.2-100％之间；基于tcga肺腺癌数据构建随机森林模型评价该12个cpg位点的综合诊断效果，准确度为99.7％，在geo数据集中验证，准确度分别为83.9％和97.9％。上述结果证明了本技术所提供的cpg位点在不同数据集的肺腺癌组织中均具有良好且稳定的区分性能。