一种干扰植物病毒的CasRx及其制备方法、重组表达载体、重组菌

本发明涉及植物抗病毒育种，尤其涉及一种干扰植物病毒的casrx及其制备方法、重组表达载体、重组菌。

背景技术：

1、植物病毒利用宿主细胞器进行复制和传播，因其种类多、繁殖快、传播途径广，加上缺少有效的防治药剂和措施，素有“植物癌症”之称。尽管在与病原物的长期互作过程中，植物进化出了固有免疫和适应性免疫机制来进行防御，但是，大多数病毒仍可以消减或逃避宿主的防御机制，对宿主细胞造成不可逆的损害。相比于动、植物等真核生物，细菌和古细菌在对噬菌体等病毒的防御上却拥有更为“先进”的武器，如经典的“限制-修饰(restriction-modification)”系统和“成簇的规律间隔短回文序列(clusteredregularly-interspaced shortpalindromic repeat，crispr)及相关蛋白(crispr associated proteins，cas)”系统。而后者crispr/cas系统是一种更为精巧、特异的获得性免疫系统。细菌利用cas核酸酶和crispr序列簇迅速检测到入侵的外来核酸并进行特异性地靶向切割。其特异性就在于这些原核生物能够捕获噬菌体基因组上的短基序，再以间隔序列的形式整合进自身的crispr序列簇中作为对外来入侵者的遗传记忆，从而对曾经感染过的噬菌体等外源核酸形成获得性免疫。因此，若将细菌的这种精妙的病毒免疫机制“移植”到植物中，将很大程度上提升植物的病毒抗性，从而以较低成本减小病毒对农作物造成的经济损失。利用原核生物的病毒防御机制开发真核生物抗病毒免疫系统也是目前许多研究者着力突破的方向。

2、目前已有一些研究利用该策略进行了针对特定病毒的育种改良尝试。在具体操作上需要rna靶向的crispr/cas13系统稳定转化作物，获得转基因植株来保证在作物的整个生长周期内随时抵御入侵的病毒。而稳定的遗传转化往往需要大量的人力、物力和时间成本来实现，因此高效的病毒靶点对于作物的抗病毒育种成败就变得至关重要。靶点的高效与否与靶点自身的属性(如二级结构特征等)相关，也与病毒基因组结构、所选的致病基因等因素有关。近几年，已有利用rna靶向的cas13家族核酸酶在动、植物体内进行抗病毒干扰的研究报道，但这些工作在具体的crrna靶点选取上，大多存在一定的随机性。高效的靶点对于特定病毒的有效防御至关重要，尤其利用cas13对于植物进行抗病毒育种改良时，依赖于转基因技术将crispr/cas13系统稳定地整合进植物基因组，这样就要求在靶点选择上务必谨慎，否则将会浪费大量的人工和时间成本。因此建立一套快速评估靶点效能的筛选系统是非常亟需和必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种干扰植物病毒的casrx及其制备方法、重组表达载体、重组菌，还提供了一种基于casrx的植物抗病毒crrna高效靶点序列的筛选方法，这种依赖于casrx转基因本生烟的供试靶点瞬时表达评估过程，大大降低了因靶点无效或低效导致的育种风险，加快了植物抗病毒育种进程。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种干扰植物病毒的casrx，编辑所述casrx的核苷酸序列如seq idno：1所示。

4、本发明还提供了所述的casrx的制备方法，包括如下步骤：将修饰后的zmcasrx序列和修饰后的ntcasrx序列通过连接肽融合得到的；

5、所述zmcasrx序列的修饰方法为：在zmcasrx序列两端融合定位肽，n端融合标签蛋白，得到修饰后的zmcasrx序列；

6、所述zmcasrx序列如seq id no：2所示；

7、所述定位肽为nls；所述标签为flag标签；

8、所述定位肽nls的序列如seq id no：3所示；所述标签flag的序列如seq id no：4所示；

9、所述ntcasrx序列的修饰方法为：在ntcasrx序列两端融合定位肽，c端融合标签蛋白，得到修饰后的ntcasrx序列；

10、所述ntcasrx序列如seq id no：5所示；

11、所述定位肽为nes；所述标签为ha标签；

12、所述定位肽nes的序列如seq id no：6所示；所述标签ha的序列如seq id no：7所示；

13、所述连接肽为2a连接肽。

14、本发明还提供了一种重组表达载体，包括编辑所述的casrx的核苷酸序列以及空载体；

15、所述空载体为psuper1300。

16、本发明还提供了一种重组菌，包括编辑所述的casrx的核苷酸序列以及空载菌；

17、所述空载菌为农杆菌。

18、在本发明中，所述农杆菌为农杆菌lba4404。

19、本发明还提供了所述的casrx、所述的重组表达载体或所述的重组菌在构建用于筛选植物抗病毒crrna高效靶点的转基因本生烟中的应用。

20、本发明还提供了一种用于筛选植物抗病毒crrna高效靶点的转基因本生烟的构建方法，包括如下步骤：将所述的casrx、所述的重组表达载体或所述的重组菌转化到本生烟中，筛选阳性株，得到转基因本生烟。

21、本发明还提供了所述构建方法构建得到的转基因本生烟在筛选植物抗病毒crrna高效靶点中的应用。

22、本发明还提供了一种基于casrx的植物抗病毒crrna高效靶点序列的筛选方法，包括如下步骤：

23、(1)将检测靶点的表达序列整合入crrna表达载体中，得到靶点载体；

24、(2)将所述的靶点载体转化至宿主菌，收集od值为0.4～0.6的菌液，得到待接种液；

25、(3)将所述的待接种液注射至转基因本生烟中，得到含有靶点的转基因烟；

26、(4)在所述含有靶点的转基因本生烟中接种目标病毒，观察接种目标病毒的转基因本生烟的病毒病症状的强弱和测定病毒含量，筛选对目标病毒干扰效率高的靶点作为靶点序列；

27、步骤(3)中，所述转基因本生烟为所述构建方法构建得到的转基因本生烟。

28、作为优选，所述检测靶点的表达序列包括spacer序列和检测靶点的反向互补序列；

29、所述spacer序列如seq id no：8所示；

30、所述检测靶点为病毒外壳蛋白基因或病毒功能基因区域内5’端富含u的22或30nt的序列，u的连续数量≥4；

31、所述crrna表达载体的构建方法如下：以基因编辑载体为骨架，删除基因编辑载体上的cas9表达盒和sgrna表达盒中的sgrna-scaffold，保留atu6-26启动子和atu6-29终止子，得到patu6-crrna表达载体，所述patu6-crrna表达载体的序列seq id no：9所示。

32、本发明还提供了所述的筛选方法在筛选植物抗病毒crrna的靶点中的应用。

33、本发明的有益效果：

34、本发明构建了的适用植物病毒的靶点筛选方法，即通过创制不同亚细胞定位的casrx转基因本生烟、合成供试靶点序列、构建靶点载体、对casrx转基因本生烟注射靶点载体、接种目标病毒、系统发病后症状和病毒粒子含量比较等一系列环节，即可在短时间内获得高效靶点信息。这种依赖于casrx转基因本生烟的供试靶点瞬时表达评估过程，大大降低了因靶点无效或低效导致的育种风险，加快了植物抗病毒育种进程。