一种抗坏血酸过氧化物酶及其编码基因与应用

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及一种来源于石蒜科植物的抗坏血酸过氧化物酶及其编码基因与应用。

背景技术：

1、抗坏血酸过氧化物酶存在于从藻类到高等植物的所有光合真核生物中，是分解h2o2的关键酶。抗坏血酸过氧化物酶利用抗坏血酸作为特定的电子供体，将h2o2还原为h2o，参与h2o2和抗坏血酸水平的调节。在细胞水平上，抗坏血酸过氧化物酶定位于产生h2o2的所有亚细胞区室，包括外质体、细胞质、质体、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体，或以可溶性形式存在，或附着在细胞器膜上。在这些细胞器中，抗坏血酸过氧化物酶参与形成抗坏血酸-谷胱甘肽循环。抗坏血酸-谷胱甘肽循环在细胞氧化还原系统网络中具有中心地位的作用，抗坏血酸过氧化物酶支持不同细胞区室内的能量敏感通信并整合植物信号通路。抗坏血酸过氧化物酶在保护植物细胞免受各种环境胁迫以及植物生长发育中起着至关重要的作用。除抗坏血酸外，抗坏血酸过氧化物酶还可以氧化芳香型底物，如对甲基苯酚(p-cresol)、3,3'-二甲氧基联苯胺(o-dianisidine)、邻甲氧基苯酚(guaiacol)和对香豆酸(p-coumarate)，具有广泛的底物谱。

2、原儿茶醛，又称3,4-二羟基苯甲醛，是一种天然存在的生物分子。原儿茶醛是苯甲醛衍生物之一，是一种芳香醛，具有一个甲酰基和两个酚羟基，属于酚类化合物。得益于这些功能基团，原儿茶醛显示出广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗微生物、抗凋亡和抗肿瘤等。此外，原儿茶醛可以参与调节心血管重构，对内皮细胞有保护作用，对心血管损伤有治疗作用。近年来，原儿茶醛可以有效地预防和治疗缺血性心脑血管疾病。在自然界中，原儿茶醛广泛存在于蔬菜、水果和农作物等植物体中。原儿茶醛还是一些中药的一种有效成分，如中药丹参。原儿茶醛还是植物天然产物生物合成的重要中间体，如加兰他敏——一种对阿尔茨海默病有治疗作用的石蒜科生物碱。

3、忽地笑(lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，能够合成原儿茶醛、加兰他敏等具有重要生物活性和应用价值的大量植物天然产物。但是，石蒜属植物抗坏血酸过氧化物酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的抗坏血酸过氧化物酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行原儿茶醛、加兰他敏的生物转化与生物合成。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的抗坏血酸过氧化物酶，所述的抗坏血酸过氧化物酶选自：

2、(a)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；或

3、(b)将seq id no:1氨基酸序列经过一个或多个(如1─50个)氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，且具有抗坏血酸过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或

4、(c)与seq id no:1氨基酸序列有至少75％序列相同性，且具有抗坏血酸过氧化物酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

5、本发明seq id no:1所示的蛋白质是从忽地笑(lycoris aurea)中分离得到的一种新的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)。为便于表述，将seq id no:1所示的蛋白质命名为laapx24999。

6、在一个优选例中，所述的抗坏血酸过氧化物酶活性是指以过氧化氢(h2o2)为底物生成水(h2o)。

7、在另一个优选例中，所述的抗坏血酸过氧化物酶具有以对羟基苯甲醛为底物合成原儿茶醛的活性。

8、在另一个优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

9、本发明的另一目的在于提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述抗坏血酸过氧化物酶的多核苷酸。

10、在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。

11、应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子。因而，本发明抗坏血酸过氧化物酶的多核苷酸还包括由seq id no:2所示核苷酸序列经取代和/或缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到的编码具有抗坏血酸过氧化物酶活性的核苷酸序列。

12、本发明的又一目的是提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。所述的载体是将本发明的编码所述抗坏血酸过氧化物酶的多核苷酸与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明所述抗坏血酸过氧化物酶的重组表达载体或抑制本发明所述抗坏血酸过氧化物酶编码多核苷酸表达的基因沉默载体。

13、在一个优选例中，该载体是含有编码所述抗坏血酸过氧化物酶的seq id no:2所示序列的重组表达载体pet28a-laapx24999。

14、在另一个优选例中，该载体是含有编码所述抗坏血酸过氧化物酶的seq id no:2所示序列中第1-738位多核苷酸的重组表达载体pet28a-laapx24999(δc45)。

15、本发明的又一目的是提供一种宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。将所述的重组表达载体或者基因沉默载体导入所述的适当宿主细胞中，获得表达本发明所述抗坏血酸过氧化物酶的基因工程菌株、转基因细胞系、转基因愈伤、转基因组织、转基因植株或者基因工程植株。

16、本发明的又一目的是提供所述的抗坏血酸过氧化物酶的用途，用于合成原儿茶醛。

17、在一个优选例中，所述的底物是对羟基苯甲醛。

18、本发明的又一目的是提供一种表达构建物。所述表达构建物包括以下酶的编码基因和/或基因表达盒：

19、(a)所述的抗坏血酸过氧化物酶；和/或

20、(b)抗坏血酸过氧化物酶底物的生物合成酶。

21、所述基因表达盒是酶在宿主细胞中表达与调控所需要的生物学元件，包括启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点、kozak序列、内含子和/或转录终止子等；此外，还可包括标签编码序列和/或信号(肽)编码序列等。

22、在一个优选例中，所述的表达构建物包括所述的抗坏血酸过氧化物酶的编码基因。

23、在另一个优选例中，所述的表达构建物还包括：对羟基苯甲醛合酶(hbs)的编码基因和酪氨酸氨基裂解酶(tal)的编码基因。

24、在另一个优选例中，当转化大肠杆菌细胞时，所述的表达构建物中，还包含大肠杆菌启动子、大肠杆菌核糖体结合位点和/或大肠杆菌转录终止子等基因表达盒。

25、本发明的又一目的是提供一种宿主细胞。所述的宿主细胞中包括所述的表达构建物。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。较佳地，所述的宿主细胞是内源存在抗坏血酸过氧化物酶的底物或其底物前体的细胞。

26、本发明的又一目的是提供所述的表达构建物的用途，用于合成原儿茶醛。

27、本发明的又一目的是提供一种生产原儿茶醛的方法。

28、在一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化对羟基苯甲醛合成原儿茶醛；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。

29、在另一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的大肠杆菌细胞，利用简单的碳水化合物(如葡萄糖)合成原儿茶醛。该宿主细胞是包含有抗坏血酸过氧化物酶的底物的细胞；较佳地，该宿主细胞是内源存在对羟基苯甲醛或其前体的细胞。

30、本发明首次揭示了石蒜科植物忽地笑来源的抗坏血酸过氧化物酶laapx24999，其具有催化对羟基苯甲醛合成原儿茶醛的能力。本发明还揭示了编码所述抗坏血酸过氧化物酶的多核苷酸、表达所述抗坏血酸过氧化物酶的表达载体及宿主细胞。本发明应用石蒜科植物来源的抗坏血酸过氧化物酶，可以进行植物天然产物原儿茶醛的生物转化以及生物合成。