一种基于CRISPR-Cas12系统光激活检测SNP（以miRNA为例）的方法

本发明属于基因检测，具体涉及一种基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法。

背景技术：

1、micrornas(mirna)是一种短的非编码核糖核苷酸序列，其长度在21个核苷酸左右。科学研究表明mirna参与控制机体的基因表达，比如在基因的转录，包括转录后的加工与遗传、表观遗传、细胞分化和个体发育等重要生命活动，很多疾病的发生发展也与mirna的表达具有较高的相关性，在疾病早期阶段中实现对相关mirna的野生型突变型进行体外检测，区分单核苷酸多态性(snp)，将有助于疾病的风险分层和进一步的诊断监测。mirna在体液中含量低、同源性高、种类繁多、序列短且极易降解，对检测方法要求极高。反转录荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)技术是目前最常规的mirna检测方法，然而该方法需要昂贵复杂的仪器设备进行精确的循环变温控制，不利于在资源匮乏地区的推广使用。因此，构建操作简便、灵敏度高、特异性强、可快速实现mirna体外检测以及区分单核苷酸多态性的方法是近年来相关领域学者的研究热点。

2、近年来，成簇规律间隔短回文重复序列crispr和相关蛋白cas组成的crispr-cas系统作为原核生物的适应性免疫系统，在基因组编辑、基因治疗和生物传感等领域得到了广泛应用。特别地，对于cas12，cas13和cas14蛋白系统开发的诊断工具，如sherlock和cas14-detectr等，成功实现了高特异性检测靶标核酸分子，甚至能够区分snp。相比于其它cas蛋白，cas12有两种基于单链或双链激活因子的crispr激活模式，分别为ssdna和带pam序列的dsdna。这两种模式在特异性或普适性方面存在技术瓶颈。限制了crispr技术在点突变检测等高精度分子识别领域的应用。研究表明，ssdna中的单碱基错配也会导致cas核酸酶的激活，特异性较差。此外，非特异性的扩增产物同样可能会激活cas，导致假阳性，其稳定性也受到限制。除了ssdna，带pam的dsdna激活cas12相对稳定，并且当突变发生在其pam内或附近时，cas不会被激活。然而，突变附近的pam在人类基因组中并不常见，因此dsdna激活模式具有局限性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，该方法以mirna为靶核酸单链，在其互补链ssdna上用pclinker修饰碱基后与靶链mirna进行rna-dna杂交，并且在365nm紫外光照射后得到立足点dsdna激活因子，成功激活crispr-cas12系统区分snp。该方法以简单灵活的方式调节反应，实现可控激活，不会造成入侵链的信号泄漏。当mirna存在单碱基错配时，杂交后立足点dsdna激活因子与crrna结合效率显著减低，被切割的报告基因产生的信号可以放大激活效率的差异，有助于特异性地区分突变目标，并且无需依赖pam序列和专业设备就能检测并且区分出野生型与突变型mirna，从而实现低成本快速灵敏对snp的检测。

2、本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

3、一种基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，以mirna为例，包括下述步骤：

4、1.杂交混合物：10μm mirna2μl，10μm pclinker修饰的互补ssdna

5、链2μl，buffer2μl，depc水14μl，加入后37℃反应10min；

6、2.在步骤1)得到杂交混合物后用365nm紫外灯照射3min后加入lbcas12a的检测体系中，进行特异性识别。

7、lbcas12a检测体系：2μl tris-醋酸buffer(10×)，30nm lbcas12蛋白，30nm lb-crrna(20ng/μl)，250nm fq探针(40μm)，2μl检测底物，用depc水补充至20μl。

8、优选地，步骤1中的pclinker修饰互补链ssdna的修饰方法为磷酸二酯键上修饰，由生工生物工程(上海)股份有限公司委托合成。

9、优选地，步骤1中mirna和pclinker修饰互补链ssdna的混合摩尔比为1:1。

10、所述pclinker修饰的互补链ssdna链中，优选距离5’端6碱基时嵌入pclinker。

11、优选地，步骤1和步骤2中的buffer为ph8.6的tris-醋酸buffer(10×)。

12、优选地，步骤2中重组蛋白lbcas12a与lb-crrna在pcr仪或水浴锅中反应，反应温度为37℃，反应时间为25min。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

14、显著区分单核苷酸多态性snp，无需pam位点的限制，无需逆转录，无需核酸扩增，通用性加强。

15、实现样品中snp的快速、灵敏检测，本方法检测仅需40min即可得到显著的检测信号。

技术特征：

1.一种基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于，pclinker修饰的互补ssdna封闭靶核酸单链之后经过紫外光照射形成立足点结构，进而偶联crispr-cas12系统进行snp检测。

2.如权利要求1所述的基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于，所述检测试剂包括：pclinker修饰的互补ssdna链、crrna、淬灭荧光探针、缓冲液以及cas12蛋白。

3.如权利要求1所述的基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于，所述靶核酸单链包括脱氧核糖核酸单链、核糖核酸单链中的任意一种。

4.如权利要求1所述的基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于，pclinker修饰的互补ssdna链封闭靶核酸单链的5’端和3’端中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述pclinker修饰互补链ssdna修饰方法为磷酸二酯键上修饰。

6.一种基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于，所诉mirna野生型为let7a时，突变型包括let7b、let7c、let7d、let7e、let7f、let7g、let7中的至少一种。

7.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，pclinker修饰互补链ssdna中pclinker的具体位点为距离5’端的1-6碱基的任意一个位点。

8.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述cas12蛋白包括lbcas12、fncas12、ascas12、lwcas12。

9.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述cas12蛋白为cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12j中的任意一种。

10.根据权利要求1所述的基于crispr-cas12系统光激活检测snp的方法，其特征在于：所诉检测方法包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12系统光激活检测SNP的方法。该方法中，根据待检测(miRNA作为RNA)靶核酸单链信息，设计、合成其PClinker基团修饰的互补ssDNA链，二者杂交后紫外光照射形成立足点，联合CRISPR‑Cas12系统将检测信号转变成荧光信号来实现核酸检测，并且区分单碱基突变。本发明所述方法材料设计简单、成本低、操作方便，并且可以在40min内直接通过荧光信号检测SNP，区分野生型与突变型，对于癌症的个性化生物标记物诊断和基因治疗方面都有重要意义。技术研发人员：宋凤阁,骆彦池,陈会友,鲁琳,邵宝凯,林志赟,万逸受保护的技术使用者：海南大学技术研发日：技术公布日：2024/8/5