基于RSV假病毒的中和抗体检测方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种基于rsv假病毒的中和抗体检测方法。本发明还涉及一种假病毒颗粒以及检测rsv抗体中和活性的方法。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒(rsv)感染可引起肺炎和毛细支气管炎，对人类健康构成重大威胁。目前，没有针对rsv感染的特异性治疗方法。最有效的预防措施是接种疫苗和预防性药物。

2、rsv进入宿主细胞导致感染是病毒生命周期的第一步。因此该过程是疫苗和预防性药物的主要靶标。疫苗和预防性药物的策略是通过疫苗诱导的抗体或基于抗体的产品来中和rsv的进入。因此，疫苗诱导抗体阻断rsv进入的能力是评估抗rsv疫苗有效性的关键因素。rsv进入主要包括两个步骤:由g蛋白(attachment)介导病毒附着到宿主细胞上，随后由f蛋白介导病毒包膜与细胞膜融合。g蛋白通过与宿主细胞附着因子(如糖胺聚糖等)相互作用，促进病毒附着于细胞表面。附着后，f蛋白与细胞表面受体相互作用，包括胰岛素样生长因子受体1(igf1r)、细胞间粘附分子-1(icam-1)、表皮生长因子受体(egfr)和核仁蛋白(ncl)。f蛋白通从亚稳态的融合前(pre-f)构象到稳定的融合后(postf)构象的转变来促进膜融合。由于f和g蛋白在rsv进入过程中起着至关重要的作用，因此它们是抗体中和的主要目标。由于g蛋白具有较高的序列多样性，可作为rsv基因型分类的基础。而蛋白在毒株之间表现出高度的保守性，并引发广谱交叉保护性免疫，使其成为开发疫苗或抗病毒药物的有希望的靶点。

3、噬斑减少中和试验(prnt)被广泛认为是中和抗体检测和定量的“黄金”标准。然而，该实验大量操作时是一项费力且具有挑战性的过程，需要熟练的实验人员基于活病毒进行操作，实验程序复杂，要求较高。而基于水疱性口炎病毒(vsv)或hiv-1病毒粒子的假病毒，是一个有效的替代方法，可以模仿真实病毒的进入过程。

4、假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。以假病毒为基础的中和试验广泛用于阐明病毒侵袭机制和评估中和抗体。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种rsv假病毒颗粒以及检测rsv抗体中和活性的方法。实现上述目的的技术方案如下：

2、一种用于包装rsv假病毒的重组表达质粒，其含有编码rsv的f蛋白的核苷酸序列，所述重组表达质粒用于表达rsv病毒f蛋白。

3、在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如seq id no:1所示，所述f蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、在其中一些实施例中，所述重组表达质粒可以是克隆载体，也可以是表达载体；在其中一些实施例中，所述载体能够在宿主细胞(例如哺乳动物的细胞)内表达如上所述的蛋白。

5、在其中一些实施例中，所述质粒选自pcaggs，plv，pcdna3.1+和pcmv。

6、本发明的目的之一还在于提供一种rsv假病毒，所述假病毒含有rsv病毒的f蛋白。

7、在其中一些实施例中，所述假病毒由如前所述的重组载体与表达萤火虫荧光素酶报告蛋白的慢病毒转移质粒(pwpxl)和慢病毒包装质粒(pspax2)共转染哺乳动物细胞而包装得到。在其中一些实施例中，所述哺乳动物细胞为293t细胞。

8、在另一方面，本发明提供了一种检测rsv假病毒感染力的方法，所述方法包括，将rsv假病毒按梯度稀释后感染宿主细胞，根据宿主细胞中报告基因的表达物所产生的信号计算假病毒滴度。

9、在其中一些实施例中，所述方法包括，将rsv假病毒按梯度稀释后与宿主细胞孵育，48小时后裂解细胞，加入荧光检测试剂检测荧光值，根据荧光值计算假病毒滴度。在其中一些实施例中，所述宿主细胞为huh7.5.1细胞。

10、在另一方面，本发明提供了一种检测rsv抗体中和活性的方法，所述方法包括，将rsv假病毒与系列稀释的待测抗体样品混合，得到的混合物感染宿主细胞，根据宿主细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性或定量检测待测样品中中和抗体的效价。

11、在其中一些实施例中，所述方法包括，将rsv假病毒与系列稀释的待测抗体样品混合后与宿主细胞孵育，48小时后裂解细胞，加入荧光检测试剂检测荧光值，根据荧光值计算抗体的中和效价。在其中一些实施例中，所述宿主细胞为huh7.5.1细胞。

12、本发明还提供了一种筛选能够抑制rsv感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，将rsv假病毒与系列稀释的候选药物样品混合，得到的混合物感染宿主细胞，根据宿主细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性或定量检测待测药物抑制rsv感染细胞的能力。

13、在其中一些实施例中，所述方法包括，将rsv假病毒与系列稀释的候选药物样品混合后与宿主细胞孵育，48小时后裂解细胞，加入荧光检测试剂检测荧光值，根据荧光值计算药物抑制rsv感染细胞的能力。在其中一些实施例中，所述宿主细胞为huh7.5.1细胞。

14、在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分:如前所述的重组质粒，如前所述的假病毒颗粒。

15、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括转染试剂；所述转染试剂包括lipofectamine2000、lipofectamine3000、pe1或其任何组合。

16、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括荧光素酶检测底物，荧光素酶检测缓冲液。

17、在其中一些实施例中，所述试剂盒用于检测rsv假病毒的感染力。

18、在其中一些实施例中，所述试剂盒用于检测rsv中和抗体的活性。

19、在另一方面，本发明提供了制备如前所述的假病毒颗粒的方法，其包括：

20、(a)用下述物质转染宿主细胞。

21、(1)编码权利要求1的重组表达质粒的目的基因。

22、(2)含有形成假病毒颗粒(例如hiv病毒样颗粒)所需的基因或元件的一个或多个辅助核酸分子；在其中一些实施例中，所述一个或多个辅助核酸分子包含gag基因、pol基因和/或env基因。

23、(b)在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，以产生假病毒颗粒：在其中一些实施例中，所述细胞为哺乳动物的细胞；在其中一些实施例中，所述细胞为293t细胞。

24、术语定义

25、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

26、如本文中所使用的，术语“rsv”是指，“呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus)”的简称，人呼吸道合胞病毒是一种包膜单链负义rna病毒，属于正肺病毒属和肺炎科。rsv基因组约15.2kb，编码11种蛋白，包括非结构蛋白(ns1、ns2)、核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、小疏水表面蛋白(sh)、转录调节因子(m2-1和m2-2)、聚合酶(l)、附着蛋白(g)和融合(f)糖蛋白。rsv分为a、b两种亚型，在不同季节交替传播。在rsv-a和rsv-b亚型中，根据g糖蛋白的遗传变异，rsv进一步分为不同的基因型。

27、如本文中所使用的，术语“假病毒”是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，所述假病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力，因此其生物安全性高。假病毒的包装系统一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，hiv-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。

28、如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于:质粒、噬菌粒、病毒等。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。

29、如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等的原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如sf9等的昆虫细胞，或者如cho细胞，cos细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞等的动物细胞。

30、如本文中所使用的，术语“中和抗体”是指具有中和活性的抗体。术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。

31、如本文所使用的，术语“转染”的意思是，将“外来”(即异源)基因、dna或rna序列引入到宿主细胞中，从而使宿主细胞会表达所引入的基因或序列，以产生期望的物质，通常是由所引入基因或序列编码的蛋白或酶。

32、发明的有益效果

33、基于以上方案，本发明提供了安全、灵敏、特异、简便的检测rsv中和抗体的方法。由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。中和试验的病毒残余量则对应于进入细胞内的病毒rna亚基因组(删除了结构基因，而代替以荧光素酶基因的病毒基因组)在细胞内表达得到荧光素酶的量。向细胞裂解液加入荧光素酶的底物发生化学发光反应后，荧光素酶的量可由化学发光仪精确定量。荧光素酶化学发光反应读数的对数在较大范围内和残留的病毒量有良好的线性关系，试验过程操作简便，对技术人员要求不高。从成本来说，该方法也比较低廉，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。

34、基于以上特点,该假病毒检测系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群中rsv特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。