一种促进植物根系发育的新型小肽RDPP的生物发酵生产方法

本发明属于农业科学技术和生物肥料学领域，具体涉及一种促进植物根系发育的新型小肽rdpp的生物发酵生产方法。

背景技术：

0、技术背景

1、面对化肥过量施用带来的土壤退化和环境污染问题，我国正寻求通过生物肥料创新，走向农业生产的可持续发展道路。在此背景下，基于微生物代谢物的新型生物肥料凭借其环境友好性和高效促生长特性，成为推动传统农业向绿色生态农业转型的关键力量。

2、新型生物肥料的研发，着重利用微生物代谢产生的植物激素类物质，如生长素(iaa)、细胞分裂素(ctk)、脱落酸(aba)、赤霉素(ga)等。这些物质能够模拟植物内源激素的作用，促进植物的生长发育，包括根系扩展、细胞分裂与伸长、调控植物对水分的吸收和利用，以及加速种子萌发和果实成熟等过程。除了传统的植物激素外，新型植物刺激物质如生物活性蛋白质和多肽，已成为植物生长调节领域的重要生长点。它们在自然环境中无毒害，不仅能够促进作物生长、提高产量和改善品质，还能增强作物的抗病能力和提高肥料利用效率。

3、新型小肽rdpp是本研究团队开发的创新性产品，其能够促进包括拟南芥、黄瓜、玉米、水稻、花生、小麦等作物根系的发育，促进养分吸收、显著提高作物产量，市场上首次被报道并已获得产品发明专利(zl202310549596.x)。虽然基于rdpp的新型生物肥料显示出了极大的潜力和应用价值，然而rdpp小肽的推广和应用关键在于能否实现大规模生产。目前，生物活性小肽的生产方式大致可分为两种类型，一种是以天然材料(灵芝、木耳、人参、牡丹、海参等)为主，通过酸碱或酶处理后分离提取的混合型肽类产品(如专利cn201910295625.8、cn202311201275.7、cn202310199366.5、cn201910963139.9等)，尽管功能多样，但其功效发挥物质往往缺乏清晰认知，产品特异性较低。另一种是针对具有特定氨基酸序列的功能型小肽，主要通过直接分离提纯制备、化学合成制备和生物发酵制备三种方法进行生产。其中，直接分离提纯制备受限于来源材料及其含量的限制，目前相关制备工艺较为缺乏；化学合成制备功能小肽具有纯度高、活性强、易量产等特性(如专利cn202311766132.0、cn202410010696.x等)，然而化学合成成本高昂且制备过程中涉及酸碱和有机试剂，具有较高的环境污染风险。生物发酵制备主要利用合成生物学底盘菌(大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌等)进行小肽基因表达，生产过程具备无污染、环境友好、产物易回收、活性强等诸多优点。然而，小肽与正常生物蛋白存在显著差异，其较小的分子量(<20aa)通常并不具有显著的三维结构，在异源小肽表达产量上面临重大挑战。如专利cn202210474703.2中经过优化的黄粉虫抗菌肽在大肠杆菌bl21宿主中胞内表达量小于500mg·l-1，并且后续生产需要面临高昂的破壁纯化成本；再比如专利cn202311490955.5同样使用大肠杆菌bl21胞内异源表达串联cm4抗菌肽，产量偏低(<100mg·l-1)且需要破壁纯化；再比如专利cn201310150083.8以酵母为异源表达对串联短肽进行胞外表达，规避了细胞破碎纯化的高成本，然而其短肽最终产量依然低于70mg·l-1。综上所述，农业应用领域的天然属性，要求功能小肽rdpp产品的生产工艺必须具备环境友好、高产、低成本等显著特征。因此，在市场缺乏植物根系发育的新型rdpp小肽生产工艺的当前背景下，如何利用生物发酵制备方法，实现rdpp的低成本量产目标是本技术专利的重点内容。

技术实现思路

1、针对天然植物促根小肽分离纯化难度大、化学合成成本高等问题，本发明目的在于提供一种本团队已申请专利202310549596.x中植物促根小肽rdpp的微生物高产发酵的基因工程菌。

2、本发明的另一目的在于提供生产植物促根小肽rdpp的基因工程菌的高产发酵方法。

3、本发明的又一目的在于提供基因工程菌所产植物促根小肽rdpp的应用。

4、本发明的目的可通过如下技术方案实现：

5、第一方面，本发明提供了一种由10个小肽rdpp基因串联的表达序列rdpp10-a基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。该rdpp10-a基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为663bp，g+c含量为50％，编码由10个植物促根小肽氨基酸(glu-pro-asp-ser-glu-glu-glu-pro-lys-glu-pro-glu-ala-ile)通过连接序列(leu-val-pro-arg-gly-ser)依次串联共220个氨基酸的多肽rdpp10-a，其氨基酸序列如seq id no.2所示。串联rdpp10中第5和第6个rdpp序列间的连接序列变为gly-gly-ile-glu-gly-arg-his-ser，其是一步克隆法成功构建rdpp10的关键序列；连接序列leu-val-pro-arg-gly-ser是串联rdpp10在大肠杆菌bl21中成功高产表达并分泌到胞外的核心序列。

6、第二方面，本发明保护一种重组质粒，含有上述串联多肽基因rdpp10-a的pet26b-rdpp10-a，通过一步克隆的方法将rdpp10-a基因合成序列精准插入pet26b表达质粒的pelb分泌信号肽序列后并融入质粒正确表达框中，通过卡那霉素筛选正确突变子并测序验证获得。

7、第三方面，本发明保护一种含有所述rdpp10-a基因或前文所述重组载体的大肠杆菌基因工程菌e.coli bl21-rdpp10-a。

8、所述的基因工程菌采用如下方法构建：所述的含有rdpp10-a基因的重组质粒pet26b-rdpp10-a通过化学转化方法导入宿主菌e.coli bl21感受态中，接着通过含有30mg·l-1卡那霉素的lb平板(10g·l-1蛋白胨，5g·l-1酵母粉和10g·l-1氯化钠)进行突变体筛选，37℃培养17h后挑取转化子，经测序验证后获得正确基因工程菌e.coli bl21-rdpp10-a，-80℃甘油保存。

9、第四方面，本发明保护一种利用基因工程菌e.coli bl21-rdpp10-a发酵生产rdpp10-a的优化方法。所述方法实施步骤如下：e.coli bl21-rdpp10-a接种于lb液体培养基中，200rpm、37℃摇床培养17～36h优选24h，8000rpm离心5min去上清，获得发酵菌体；将菌体重新转接到新鲜lb液体培养基中，添加0.5～1.5mm优选0.5mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和0.2～1.0％(w/v)优选0.4％(w/v)甘氨酸于17～37℃优选30℃、200rpm诱导发酵培养17～36h优选24h。然后，8000转离心去除菌体，上清液通过sds-page凝胶电泳验证串联多肽的表达情况，通过bca法测定植物促根串联多肽的表达量达到1.63g·l-1。

10、第五方面，本发明保护一种低成本制备rdpp单体的生产方法，利用上述高产工程菌e.coli bl21-rdpp10-a生产高浓度rdpp10-a发酵液，并基于所设计的rdpp10-a独有序列，从而允许通过廉价木瓜蛋白酶对rdpp10-a进行酶解单体释放，并且不影响rdpp单体效价。酶解条件为0.05～0.5％(g/g)优选0.1％(g/g)木瓜蛋白酶于25℃(室温)下处理10～30h优选17h水解串联rdpp10多肽释放植物促根小肽rdpp单体。整体成本能够控制在3.5元·l-1。

11、在具体的实施方案中，基因工程菌e.coli bl21-rdpp10-a经发酵罐逐级扩大发酵，经工业离心去除菌体获得的发酵液上清，利用0.05～0.5％(g/g)优选0.1％(g/g)木瓜蛋白酶于25℃静置水解10～30h优选17h，然后经喷雾干燥获得rdpp小肽粉末状制品。

12、第六方面，本发明保护前文所述的方法制备得到的小肽rdpp。

13、第七方面，本发明还保护前文所述的小肽rdpp在植物生长发育或促进植物根系发育中的应用。

14、优选的，本发明还保护前文所述的小肽rdpp在制备促进植物生长发育制剂中的应用。

15、优选的，所述的植物为模式植物、粮食作物或经济作物，优选为拟南芥、番茄、大豆、玉米或水稻。

16、上述大肠杆菌发酵生产的植物促根小肽rdpp在拟南芥植株上的促生效果验证。相同摩尔浓度下(0.03μm～10μm)，本技术所产rdpp与申请专利202310549596.x中天然提取rdpp在拟南芥促根效果上相当。

17、本发明的有益效果：

18、本技术通过将植物促根小肽rdpp通过促表达连接序列leu-val-pro-arg-gly-ser以10个重复序列的串联形式在大肠杆菌bl21的周质空间进行表达，并经诱导条件优化、木瓜蛋白酶解聚等步骤实现了rdpp的微生物高产发酵生产，摇瓶产量能够达到1.63g·l-1。

19、本发明通过对拟南芥的促根实验，验证了大肠杆菌产rdpp的活性效果。整体上，为植物促根小肽rdpp走向农业实际应用提供了经济可行的高产发酵策略。