用于发酵生产骨化二醇或其衍生物的融合蛋白、核酸、含其的菌株及应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一种用于发酵生产骨化二醇或其衍生物的融合蛋白、核酸、含其的菌株及应用。

背景技术：

1、维生素d3(v-d3)，又称胆钙化醇，作为维生素d家族成员中最重要的成员之一，并且与人体及动物健康紧密联系。维生素d3本身不具有活性，在人体内须经过肝脏和肾脏的一系列转化，形成活性形式25-oh-d3(骨化二醇)或1，25-(oh)2-d3(骨化三醇)才能被利用，在这个转化过程中最关键的一步就需要d3-25-羟化酶(即细胞色素p450酶)的参与。

2、目前生产25-羟基维生素d3的常用方法有化学合成法与生物转化法。化学合成25-羟基维生素的方法相当丰富，但路线反应步骤多，往往需要多步的保护与脱保护、光照反应、开环和异构化等多步反应，分离纯化复杂，收率低，成本高且不环保，从而阻碍了活性维生素d3无法在临床上大量使用。相比之下，生物转化法能完成一些化学合成难以进行的反应，具有较强的区域选择性和立体选择性，在温和均一的条件下容易实现自动化和反应的重现性，且能耗低，对环境的污染小，是极具应用前景的技术手段。所以，利用生物转化法制备活性维生素d3受到了人们的广泛重视。目前，已发现的催化维生素d3实现25位羟基化反应的p450催化系统主要为真核p450酶和单独的还原酶(cytochrome p450 reductase，cpr)组成的双组份系统，以及细菌p450酶和一对氧化还原伴侣蛋白组成的三组分系统，但两种系统均存在电子传递效率低、蛋白表达量低、组分复杂等问题。

3、来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)的p450酶bm3中，其p450结构域与它的cpr结构域天然融合，为自洽型p450酶。cn114507648a首次公开了bm3可以用于催化维生素d3生成25-羟基维生素d3，并构建了几种bm3的突变体蛋白，相比野生型bm3具有提高的催化能力，但仍然存在催化底物浓度低，转化速度慢，转化时间长的问题。

4、目前，主流使用大肠杆菌或其他细菌表达的维生素d3羟化酶属于胞内酶，该酶和电子传递链相关的蛋白均位于细胞质或细胞质膜；使用发酵液直接转化或者静息全细胞转化时，细胞壁及细胞膜会阻碍底物和产物在细胞内外的交换，羟基化产率较低；使用破壁后的细胞转化，由于细胞组分复杂，势必为后序的提取精制增加负担。因此在目前研究基础上，提高底物转化率、缩短转化周期、精简后提取步骤仍是生物转化法生产25-羟基维生素d3亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术生产骨化二醇存在的底物转化率低、转化速度慢、转化时间长的问题，提供一种用于发酵生产骨化二醇或其衍生物的融合蛋白、核酸、含其的菌株及应用，以实现更高的胆固醇或其衍生物合成25-羟基胆固醇或其衍生物的效率。本技术利用生物转化法将编码过氧化酶的基因克隆，并重组到毕赤酵母表达载体中，构建可表达过氧化酶的基因工程菌株。此外，通过表达折叠和分泌相关分子伴侣蛋白，提高胞外上清中过氧化酶的表达量和催化效率。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明的第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含过氧化酶和过氧化氢再生酶，所述过氧化酶与所述过氧化氢再生酶通过连接子连接。

4、本发明一些实施方案中，所述连接子选自柔性连接子、刚性连接子或可剪切连接子。

5、本发明一些实施方案中，所述柔性连接子可为本领域常规，例如为(ggggs)n(seqid no:70)，其中n＝1-4；或者(sg)n，其中n＝5-8；或者(g)n，其中n＝6或8。

6、本发明一些实施方案中，所述刚性连接子可为本领域常规，例如为(eaaak)n(seqid no:71)，其中n＝1-3。

7、本发明一些实施方案中，所述可剪切连接子可为本领域常规，例如为plglwa(seqid no:72)。

8、本发明一些具体实施方案中，所述连接子为(ggggs)3或(sg)5-8。

9、本发明一些实施方案中，所述过氧化酶选自来自黑杨环伞(cyclocybeaegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)和纳布氏蜜环菌(armillarianabsnona)的过氧化酶。

10、本发明一些实施方案中，所述过氧化酶为来自黑杨环伞(cyclocybe aegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)或纳布氏蜜环菌(armillaria nabsnona)的过氧化酶。

11、本发明一些实施方案中，所述过氧化氢再生酶为葡萄糖氧化酶。

12、本发明一些实施方案中，所述葡萄糖氧化酶选自来自黑曲霉(aspergillusniger)、黑酵母菌(aureobasidium pullulans)、灰霉菌(coprinopsis cinerea okayama)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、扩展青霉(penicillium expansum)和里氏木霉(trichoderma reesei qm6a)的葡萄糖氧化酶。

13、本发明一些实施方案中，所述葡萄糖氧化酶为来自黑曲霉(aspergillus niger)、黑酵母菌(aureobasidium pullulans)、灰霉菌(coprinopsis cinerea okayama)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、扩展青霉(penicillium expansum)或里氏木霉(trichoderma reesei qm6a)的葡萄糖氧化酶。

14、本发明一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id nos:1-3任一所示的氨基酸序列。

15、本发明一些具体实施方案中，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id nos:4-9任一所示的氨基酸序列。

16、本发明一些具体实施方案中，所述连接子为(sg)5。

17、本发明一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

18、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

19、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

20、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

21、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

22、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

23、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，所述连接子为(sg)5。

24、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列，所述连接子为(sg)5。

25、本发明的第二方面提供一种酶组合，所述酶组合包含过氧化酶和过氧化氢再生酶；

26、所述过氧化酶选自来自黑杨环伞(cyclocybe aegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)和纳布氏蜜环菌(armillaria nabsnona)的过氧化酶。

27、本发明一些实施方案中，所述过氧化酶为来自黑杨环伞(cyclocybe aegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)或纳布氏蜜环菌(armillaria nabsnona)的过氧化酶。

28、本发明一些实施方案中，所述过氧化氢再生酶为葡萄糖氧化酶。

29、本发明一些实施方案中，所述葡萄糖氧化酶选自来自黑曲霉(aspergillusniger)、黑酵母菌(aureobasidium pullulans)、灰霉菌(coprinopsis cinerea okayama)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、扩展青霉(penicillium expansum)和里氏木霉(trichoderma reesei qm6a)的葡萄糖氧化酶。

30、本发明一些具体实施方案中，所述葡萄糖氧化酶为来自黑曲霉(aspergillusniger)、黑酵母菌(aureobasidium pullulans)、灰霉菌(coprinopsis cinerea okayama)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、扩展青霉(penicillium expansum)或里氏木霉(trichoderma reesei qm6a)的葡萄糖氧化酶。

31、本发明一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id nos:1-3任一所示的氨基酸序列。

32、本发明一些具体实施方案中，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id nos:4-9任一所示的氨基酸序列。

33、本发明一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

34、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

35、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列。

36、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

37、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:2所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

38、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列。

39、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，所述连接子为(sg)5。

40、本发明另一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述葡萄糖氧化酶包含如seq id no:9所示的氨基酸序列，所述连接子为(sg)5。

41、本发明一些实施方案中，所述酶组合还包含分子伴侣蛋白。

42、本发明一些较佳实施方案中，所述分子伴侣蛋白为来源于真菌的分子伴侣蛋白。

43、本发明一些具体实施方案中，所述真菌优选为酵母，例如毕赤酵母。

44、本发明一些具体实施方案中，所述分子伴侣蛋白选自cpr5、ero1、erv5、hac1、pdi1和kar2。

45、本发明一些具体实施方案中，所述分子伴侣蛋白优选包含如seq id nos:10-15任一所示的氨基酸序列。

46、本发明的第三方面提供一种过氧化酶在制备骨化二醇或其衍生物中的应用，所述制备通过对底物第25位进行酶催化的羟基化实现。

47、所述过氧化酶选自来自黑杨环伞(cyclocybe aegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)和纳布氏蜜环菌(armillaria nabsnona)的过氧化酶。

48、本发明一些实施方案中，所述过氧化酶为来自黑杨环伞(cyclocybe aegerita)、银白伞菌(leucoagaricus leucothites)或纳布氏蜜环菌(armillaria nabsnona)的过氧化酶。

49、本发明中，所述骨化二醇衍生物是指不同的取代基取代骨化二醇上基团而形成的物质，例如骨化三醇、阿法骨化醇或帕立骨化醇。

50、本发明一些具体实施方案中，所述过氧化酶包含如seq id nos:1-3任一所示的氨基酸序列。

51、本发明的第四方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的融合蛋白，或者如本发明第二方面所述的酶组合。

52、本发明一些实施方案中，编码所述融合蛋白的多核苷酸具有如seq id nos:62-67任一所示的序列。

53、本发明一些实施方案中，编码所述酶组合的多核苷酸中，编码所述酶组合中的过氧化酶的多核苷酸具有如seq id nos:59-61任一所示的序列。

54、本发明一些实施方案中，编码所述酶组合的多核苷酸中，编码所述酶组合中的过氧化氢再生酶的多核苷酸具有如seq id nos:28或29所示的序列。

55、本发明的第五方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如本发明第四方面所述的多核苷酸。

56、本发明一些实施方案中，所述重组表达载体的骨架为质粒。

57、本发明一些实施方案中，所述重组表达载体还包含外源启动子，所述外源启动子选自诱导型启动子或组成型启动子。

58、本发明一些具体实施方案中，所述质粒为ppiczαa或ppic9k。

59、本发明一些具体实施方案中，所述诱导型启动子为aox1。

60、本发明一些实施方案中，所述组成型启动子为pgap、pgal1、ptdh3、pypd1或phxt3。

61、本发明一些实施方案中，所述诱导型启动子控制过氧化酶的基因转录。

62、本发明一些实施方案中，所述组成型启动子控制过氧化氢再生酶和/或分子伴侣蛋白的基因转录。

63、本发明的第六方面提供一种重组细胞，所述重组细胞包含如本发明第四方面所述的多核苷酸和/或如本发明第五方面所述的重组表达载体。

64、本发明一些实施方案中，所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。

65、本发明一些实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌。

66、本发明一些实施方案中，所述真核细胞为酵母。

67、本发明一些具体实施方案中，所述酵母为毕赤酵母(pichia pastoris)，例如毕赤酵母gs115。

68、本发明的第七方面提供一种制备如本发明第六方面所述的重组细胞的方法，所述方法包括将如本发明第四方面所述的多核苷酸和/或如本发明第五方面所述的表达载体导入宿主细胞的步骤。

69、本发明的第八方面提供一种培养如本发明第六方面所述的重组细胞的方法，所述方法包括对所述重组细胞依次进行诱导培养和发酵培养。

70、本发明一些实施方案中，所述诱导培养满足以下一种或多种条件：所述诱导培养的培养基为bmgy培养基；诱导培养的温度为15-25℃；所述诱导培养包含加入诱导剂；

71、所述发酵培养满足以下一种或多种条件：所述发酵培养的培养基为bmmy培养基；发酵培养的温度为25-30℃，优选为28-30℃。

72、本发明一些实施方案中，所述诱导培养的温度为18-22℃。

73、本发明一些实施方案中，所述诱导剂为5-氨基酮戊酸(5-ala)和甲醇的混合物。

74、本发明一些具体实施方案中，在1l发酵液中，5-氨基酮戊酸的用量为100-200mg，甲醇的用量为1％(v/v)。

75、本发明的第九方面提供一种如本发明第一方面所述的融合蛋白、如本发明第二方面所述的酶组合、如本发明第四方面所述的多核苷酸、如本发明第五方面所述的重组表达载体或者如本发明第六方面所述的重组细胞在制备骨化二醇或其衍生物中的应用；所述制备通过对底物第25位进行酶催化的羟基化实现。

76、本发明一些实施方案中，所述底物为维生素d3或胆固醇。

77、本发明的第十方面提供一种制备骨化二醇或其衍生物的方法，所述方法包括在如本发明第一方面所述的融合蛋白，或者如本发明第二方面所述的酶组合存在时，反应体系中维生素d3或胆固醇的第25位发生羟基化反应。

78、本发明一些实施方案中，所述羟基化反应的反应温度为30-45℃，时间为2-7h。

79、本发明一些实施方案中，所述反应体系还包括助溶剂和/或辅底物。

80、本发明一些实施方案中，所述维生素d3或胆固醇的溶剂为异丙醇和/或乙醇。

81、本发明一些实施方案中，所述维生素d3或胆固醇的初始浓度为3-5g/l。

82、本发明一些实施方案中，所述融合蛋白或酶组合的使用形式为酶液。

83、本发明一些实施方案中，所述助溶剂选自甲基-β-环糊精、羟丙基-α-环糊精和羟丙基-β-环糊精。

84、本发明一些实施方案中，所述助溶剂为羟丙基-β-环糊精。

85、本发明一些实施方案中，所述助溶剂的浓度为30-50g/l。

86、本发明一些实施方案中，所述辅底物为葡萄糖。

87、本发明一些实施方案中，所述辅底物的浓度为0.05mol。

88、本发明一些实施方案中，所述酶液为如本发明第六方面所述的重组细胞的发酵液。

89、本发明一些实施方案中，所述发酵液的用量优选为90-95％(v/v)。

90、本发明所用试剂和原料均市售可得。

91、本发明的积极进步效果在于：

92、本发明利用基因工程技术将真菌来源的过氧化酶和葡萄糖氧化酶进行融合或分别表达，并将其构建入能够稳定分泌过氧化酶和葡萄糖氧化酶的毕赤酵母菌株中，获得基因工程菌株，对菌株诱导培养，分离出表达的融合蛋白或酶混合液，利用该种酶具有将胆固醇或其衍生物转化为25-羟基胆固醇或其衍生物的能力。其中，融合表达的酶由于催化出来的辅因子与过氧化酶，时空距离较近，更易被利用，催化胆固醇或其衍生物合成25-羟基胆固醇或其衍生物的转化率最高，催化胆固醇合成25-羟基胆固醇时的转化率达到88.6％；催化维生素d3合成25-羟基维生素d3时的转化率达到91.3％。