一种多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法。

背景技术：

1、1,3-丙二胺是一种用途十分广泛的二胺类化合物，能够参与合成多种配合物，广泛应用于微电子、多孔材料等领域。也能够用作固化剂与环氧树脂反应生成具有实用价值的三维立体结构，亦或者作为原料合成抗辐射药氨磷汀。

2、目前1,3-丙二胺的化学合成方法包括卤代烃氨解法、丙烯腈氨解法和丙二醇氨解法。其中，卤代烃氨解法是一种釜式间歇式反应，以1,3-二氯丙烷为原料合成1,3-丙二胺，具有对设备腐蚀程度较高、产生的废弃物较多、原料消耗较大、多胺副产物多的缺点，其合成路线如下所示：

3、

4、丙烯腈氨解法主要是先将氨与丙烯腈反应制备3-氨基丙腈，再经催化加氢得到1,3-丙二胺，其具有工艺简单，条件温和、原料来源广泛等优点，是目前制备1,3-丙二胺较为通用的方法，但该方法存在两步法工艺复杂、催化剂成本高和难以大规模生产的问题。丙二醇氨解法以丙二醇为原料合成1,3-丙二胺，其合成路线如下所示：

5、

6、丙二醇氨解法具有流程简单、无污染等优势，但该方法中产物分离困难、催化剂和原料成本较高。因此，仍需要对1,3-丙二胺的其他合成方法进行进一步探究。

7、在一些微生物如假单胞菌属和不动杆菌属中检测到1,3-丙二胺的产生，使生物合成1,3-丙二胺成为可能。参阅图1，鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)利用c4途径合成1,3-丙二胺，该途径以l-天冬氨酸为前体生成天冬氨酸半醛，进而在2-酮戊二酸-4-氨基转移酶(dat)、l-2，4-二氨基丁酸酯脱羧酶(ddc)的催化作用下合成1,3-丙二胺；铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)利用c5途径合成1,3-丙二胺，该途径以l-谷氨酸为前体，通过一系列酶催化反应，经鸟氨酸或精氨酸合成1,4-丁二胺，进而在亚精胺合成酶(spee)的催化作用下合成亚精胺，亚精胺在亚精胺脱氢酶(spdh)的作用下合成1,3-丙二胺。鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌属于致病菌，因此有研究利用相关途径酶元件的异源表达，在大肠杆菌中构建了生产1,3-丙二胺的工程化大肠杆菌菌株，并且最终发酵产生13g/l的1,3-丙二胺。但是目前生物合成1,3-丙二胺的方法仍然存在耗能较大，对环境不友好，转化率较低等问题。因此，有必要对1,3-丙二胺的其他生物合成方法如生物酶法进行进一步探究，但目前为止还有利用多酶级联反应合成1,3-丙二胺的相关研究。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法。

2、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

3、一种多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，包括如下步骤：

4、(1)以甘油为底物，使用含醇脱氢酶和转氨酶的催化剂，催化合成3-氨基-1,2-丙二醇；

5、(2)利用脱水酶催化3-氨基-1,2-丙二醇合成3-氨基丙烷醛，利用转氨酶催化3-氨基丙烷醛合成1,3-丙二胺。

6、与现有技术相比，本发明利用多酶级联催化甘油合成1,3-丙二胺，其转化率高达77％，显著高于发酵法合成1,3-丙二胺，为利用甘油合成高附加价值的化合物提供了一条潜在的方向，此外，本方法具有流程简单、条件温和、产物易分离等优势。

7、进一步，所述脱水酶的氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示。

8、进一步，所述脱水酶的氨基酸序列如seq id no:9所示。

9、进一步，所述糖醇氧化酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述转氨酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、进一步，所述糖醇氧化酶的添加量为100～200μg/ml，所述转氨酶的添加量为5～10mg/ml，所述脱水酶的添加量为4～8mg/ml。

11、进一步，步骤(1)催化反应6h后添加所述脱水酶至步骤(1)的反应体系中。

12、进一步，所述多酶级联的反应ph为8，反应温度为45℃。

13、进一步，所述转氨酶的胺供体为丙氨酸。

14、进一步，所述多酶级联的反应体系还包括丙氨酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶。

15、进一步，其氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示。

技术特征：

1.一种多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述脱水酶的氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示。

3.根据权利要求2所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述脱水酶的氨基酸序列如seq id no:9所示。

4.根据权利要求3所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述糖醇氧化酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述转氨酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5.根据权利要求1～4任一所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述糖醇氧化酶的添加量为100～200μg/ml，所述转氨酶的添加量为5～10mg/ml，所述脱水酶的添加量为4～8mg/ml。

6.根据权利要求5所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，步骤(1)催化反应6h后，添加所述脱水酶至步骤(1)的反应体系中。

7.根据权利要求6所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述多酶级联的反应ph为8，反应温度为45℃。

8.根据权利要求7所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述转氨酶的胺供体为丙氨酸。

9.根据权利要求8所述多酶级联催化合成1,3-丙二胺的方法，其特征在于，所述多酶级联的反应体系还包括丙氨酸脱氢酶和亚磷酸脱氢酶。

10.一种脱水酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、或seq id no:9所示。

技术总结本发明涉及一种多酶级联催化合成1,3‑丙二胺的方法，包括如下步骤：(1)以甘油为底物，使用含醇脱氢酶和转氨酶的催化剂，催化合成3‑氨基‑1,2‑丙二醇；(2)利用脱水酶催化3‑氨基‑1,2‑丙二醇合成3‑氨基丙烷醛，利用转氨酶催化3‑氨基丙烷醛合成1,3‑丙二胺。本发明的多酶级联催化合成1,3‑丙二胺的方法在最适条件下，利用纯甘油和粗甘油合成1,3‑丙二胺的转化率分别达到77％和79％。同时，本发明还提供一系列用于催化3‑氨基‑1,2‑丙二醇合成3‑氨基丙烷醛的脱水酶，其中，脱水酶KpGDHT/Q337A/S302D的酶活为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的甘油脱水酶的4.4倍。技术研发人员：郑穗平,廖道成,唐士茗,林影受保护的技术使用者：华南理工大学技术研发日：技术公布日：2024/8/5