与人PD-L1结合的羊驼源双特异性抗体

本发明属于生物，具体涉及用于治疗和诊断癌症用的抗人pd-l1纳米抗体序列。

背景技术：

1、根据globocan 2018的数据，癌症仍然是全世界导致死亡的重要原因之一，并且患者的数量还在急剧上升。新型抗癌药物的研发具有重要的临床应用价值。传统的癌症疗法包括手术、化疗和放疗，能够直接去除、杀死或抑制癌细胞。免疫疗法是近年兴起的热门癌症疗法，被称为治疗癌症的第四架马车。通过使用免疫检查点抑制剂来恢复患者自身的免疫系统以抑制肿瘤细胞，从而开辟了一条新的治疗癌症的途径，改变了晚期恶性肿瘤的治疗前景。目前，多个免疫检查点及其抑制剂被开发，在这些检查点抑制剂中，又以阻断程序性死亡1(pd-1)：程序性死亡配体1(pd-l1)的单克隆抗体(mab)最为成功。美国食品药品监督管理局(fda)已批准两种抗pd-1的单克隆抗体(pembrolizumab和nivolumab)和三种抗pd-l1的mab(atezolizumab，durvalumab，avelumab)用于临床治疗多种癌症，包括黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌和肾癌。

2、以上所有批准的pd-1/pd-l1抑制剂均是经典的抗体，尽管具有良好的抗癌疗效，但它们仍然有一些固有的缺陷，如制备工艺复杂、价格高、分子量大导致穿透性差等，另外其fc段介导的细胞毒性免疫反应可能会导致额外的t细胞死亡。因此寻找开发新型抑制剂依然具有很好的临床应用价值。在驼科动物体内存在一类独特的抗体，其天然无轻链，仅由重链组成，其可变区被称为vhh，其直径不超过10纳米，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体仅由单个ig样结构域组成，与常规抗体相比，其组织穿透能力更强，也更容易设计为多价形式，其稳定性也更好。基于这些优点，开发针对pd-l1:pd-1信号轴的阻断性纳米抗体值得期待。

技术实现思路

1、本公开提供了能以高亲和力结合人pd-l1的羊驼源重链抗体可变区序列(vhh)，该可变区序列又称为纳米抗体，其能够用于治疗和/或诊断癌症。

2、发明人采用体外重组表达的人pd-l1胞外段蛋白对1头小羊驼进行3次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞并抽提细胞的总rna，随后反转录为cdna。再以此cdna为模板，用特异引物扩增出纳米抗体序列并构建噬菌体展示文库，再用人pd-l1胞外段蛋白对文库进行筛选，从而获得多个能够结合人pd-l1抗体，其中亲和力较高的2个纳米抗体分别命名为al1-43和al1-39，其中，al1-43的氨基酸序列如下：

3、

4、al1-39的氨基酸序列如下：

5、

6、所述纳米抗体al1-43的3个抗原互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)如上划线部分所示，具体地：

7、cdr1：sgftfdyyais(seq id no:3)

8、cdr2：gvscisssdgsdgsty(seq id no:4)

9、cdr3：gwrlcrgenydml(seq id no:5)。

10、所述纳米抗体al1-39的3个抗原互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)如上划线部分所示，具体地：

11、cdr1：sgrtfvsyamg(seq id no:6)

12、cdr2：fvaaiswsgaktn(seq id no:7)

13、cdr3：ltavvhtttldyd(seq id no:8)。

14、具体地，本发明提供以下技术方案：

15、1.与人pd-l1结合的抗体或其抗原结合片段，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，其具有vhh，其中所述vhh包含：

16、cdr1，其包含seq id no:3或seq id no:6所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

17、cdr2，其包含seq id no:4或seq id no:7所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；和

18、cdr3，其包含seq id no:5或seq id no:8所示的序列，与所述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。

19、2.根据项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：

20、(a)如seq id no:3所示的cdr1，如seq id no:4所示的cdr2和如seq id no:5所示的cdr3；和

21、(b)如seq id no:6所示的cdr1，如seq id no:7所示的cdr2和如seq id no:8所示的cdr3。

22、3.根据项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的任一序列：

23、(a)如seq id no：1所示的氨基酸序列；

24、(b)与如seq id no：1所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列；

25、(c)如seq id no：2所示的氨基酸序列；

26、(d)与如seq id no：2所示的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。

27、4.根据项目1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含fc结构域，优选igg fc结构，更优选人igg1 fc结构域。

28、5.与人pd-l1结合的双特异性抗体或其抗原结合片段，优选所述双特异性抗体或其抗原结合片段源自羊驼，其(例如以n端到c端的顺序)包括两个根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段相互结合，所述抗体或其抗原结合片段之间用接头(例如柔性多肽链，例如gs接头，优选(ggggs)3)连接。

29、6.项目5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其进一步具有fc结构域，优选igg fc结构域，更优选人igg1 fc结构域。

30、7.多核苷酸，其编码项目1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或项目5-6中任一项中所述的双特异性抗体或其抗原结合片段。

31、8.表达载体，其包含项目7所述的多核苷酸。

32、9.宿主细胞，其包含项目7所述的多核苷酸或者项目8所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

33、10.药物组合物，其含有项目1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目5-6中任一项中所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，项目7所述的多核苷酸，项目8所述的表达载体或者项目9所述的宿主细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

34、11.项目1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目5-6中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，项目7所述的多核苷酸，项目8所述的表达载体或者项目9所述的宿主细胞，项目10所述的药物组合物在制备治疗和/或诊断癌症的药物或试剂盒中的用途，优选地，所述癌症选自黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌、肾癌。

35、12.用于非诊断目的的检测pd-l1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用项目1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目5-6中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，优选地，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

36、定义：

37、双特异性抗体：本发明中指的是结合在不同抗原表位的两个纳米抗体的联合体。

38、本发明的优点和积极效果

39、本发明所述双特异性抗体al1-43-39是由纳米抗体al1-43和al1-39融合而成，这两个抗体均能高亲和力结合人pd-l1胞外段，亲和力kd值分别为1.54×10-9m和1.2×10-9m。当融合形成双特异性抗体al1-43-39后，其结合人pd-l1胞外段的亲和力大大增强，亲和力kd值为1.79×10-11m。此外，al1-39能够阻断人pd-1和pd-l1之间的结合。