一种P450单加氧酶及其在生物合成3-苯丙醇的应用的制作方法

本发明涉及3-苯丙醇合成，具体而言，涉及一种p450单加氧酶及其在生物合成3-苯丙醇的应用。

背景技术：

1、3-苯丙醇是一类非常重要的化合物,可作为药物中间体、香料以及催化剂,在有机合成和药物合成中有广泛的应用。现有的3-苯丙醇合成技术还存在着过度氧化、副产物多、反应条件苛刻等不足。生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备3-苯丙醇的新途径。但现有研究表明，高活性和高区域选择性的3-苯丙醇合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是3-苯丙醇生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。

2、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种p450单加氧酶及其在生物合成3-苯丙醇的应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种p450单加氧酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明从ncbi数据库中基于公开的hyphomicrobiales bacterium菌种的信息，克隆获得了编码p450单加氧酶的基因，将其构建到基因工程菌上，经过诱导表达，获得了p450单加氧酶。对该p450单加氧酶进行功能性研究，发现该p450单加氧酶具有生物合成3-苯丙醇的功能。相对于现有的3-苯丙醇的制备方法，使用本发明提供的p450单加氧酶进行生物合成3-苯丙醇，具有反应速率高，耗时短的技术优势；本发明提供的p450单加氧酶在合成3-苯丙醇时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和；此外，本发明提供的p450单加氧酶在合成3-苯丙醇时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的p450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便。

5、上述单加氧酶中含有血红素单元。

6、seq id no.2所示的氨基酸序列如下：

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8、dpvhyctesaygpywsitkyndimavdtnhqvfsseagvggiiid

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17、第二方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的p450单加氧酶。

18、在本发明提供了上述p450单加氧酶的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述p450单加氧酶的核酸序列，这对本领域技术人员来说是容易实现的。

19、例如，分离的核酸分子具有如下seq id no.1所示的核苷酸序列：

20、atgagtcaggcagcctttgccgttcagagtgcagtggaagaagcctatgccaccccgctggatcagattgatgtgagccagccgcgcctgtttaaagaaaatgcaatttggccgtttttcgaacgcctgcgtgccgaagatccggtgcattattgtgccaccagcccgtttggcccgtattggagtgtgaccaaatataatgatatcatggcagttgataccaatcataaagtgtttagcagtgaaagcggtctgggcggcattaccattcgcgatccgattgcagattttcgtctgccgatgtttattgccatggatcagccgaaacatgatgaacagcgcaaagttgttagcccgattgttgcaccgaataatctggcagcactggaaggcctgattcgtgaacgcgccggcgccattctggatggcctgcctcgtaatgaaacctttaattgggttgatcgcgtgagtattgaactgaccacccagatgctggcaaccctgtttgattttccgtgggaagatcgtcgcaaactgacctattggagcgatgttgcaaccgccgatattaatggcggtctgattagcagcatggatgaacgtcgcgaaattctgatgcagtgcgccgaatattttacccgtctgtggaatgaacgtgtgaatgaaaaagaaccgaaaggcgatctgattagtatgctggcccatggtgaagccacccgcaatatggatccgctggaatatctgggtaatattattctgctgattgttggtggcaatgataccacccgtaatagtattagtggtggtctgctggcactgaatgaatttccggatcagtatgataaactgctggcagatccgagtctggtggaaaccatggttccggaaattattcgctggcagaccccgctggcccacatgcgtcgtaccgcactggaagatgttgaactgggtggcaaactgattaaaaaaggcgataaagttgtgatgtggtatgtgagcggtaatcgcgatggcgaagtgattgatcgcccggatgaatttattattgatcgtgcccgcccgcgccagcatctgagttttggctttggtattcatcgttgtgttggtaatcgcctggccgaaatgcagctgcgcgtgctgtgggaagaaattctgaaacgttttggtaaaatcgaagtggtgggtgcaccgggtcgcgtgctgagcaattttgtgaaaggttttgataatctgccggtgcgcattccgggttaa。

21、第三方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子。

22、载体包括不限于细菌表达载体、真菌表达载体等，只要能实现上述核酸分子的表达、实现上述核酸分子的穿梭的载体均可行。包括不限于，质粒等。细菌表达载体如大肠杆菌表达载体、链霉菌或分枝杆菌表达载体。真菌表达载体例如酵母载体。

23、第四方面，本发明还提供了一种重组菌，其包括上述的载体。

24、在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌为细菌或真菌；

25、在本发明应用较佳的实施方式中，细菌为大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

26、真菌例如酵母。

27、在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌是指菌的休止细胞、重组菌的活细胞、重组菌的死菌和重组菌的细胞破碎物中的至少一种。

28、上述重组菌(或基因工程菌)，由通过本领域常规方法将重组表达载体转化至宿主微生物中制得；宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的p450单加氧酶基因可被有效表达即可；较佳地，可通过下述方法制得:将重组载体pet-28a(+)-p450转化至大肠杆菌bl21(de3)中。

29、休止细胞，也称为静息细胞，是一种特殊的细胞状态。在这种状态下，细胞不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，并具有氧化和发酵能力。在适宜的条件下，休止细胞可以重新恢复生长。休止细胞的特点包括：a.细胞保持生长潜力：尽管处于休眠状态，但在给予适当刺激时，这些细胞可以重新进入细胞周期并恢复增殖能力。b.专一性强：休止细胞在反应中的专一性较强，可以提高底物转化率。c.不易染杂菌：由于其特性，休止细胞在使用过程中可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。

30、重组菌的死菌包括不限于通过热、压力、辐射等方式灭活后获得的菌。

31、细胞破碎物是指：包括不限于通过超声、机械、化学、生物等方式使得细胞膜通透性改变，致使细胞内容物外泄，由此获得细胞破碎物。

32、在本发明应用较佳的实施方式中，死菌选自死菌的沉淀物和死菌的无细胞上清中的至少一种。死菌的无细胞上清是指去除死菌体外壳，剩余的“渗出内容物”。

33、第五方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括上述的载体，细胞为昆虫细胞。

34、昆虫细胞例如选自昆虫卵巢细胞(如sf9细胞等)。

35、第六方面，本发明还提供了一种固定化酶，通过载体或无载体的方法将上述的p450单加氧酶固定制得。

36、在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行固定的方法选自吸附法、交联法和包埋法中的至少一种。

37、吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将酶吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

38、交联法是采用双功能或多功能试剂与酶表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得酶被固定。

39、包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化酶。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将酶包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将酶与胶溶液混合，经造粒而成。

40、第七方面，本发明还提供了一种固定化细胞，将上述的菌或上述的细胞进行固定制得。

41、在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行细胞固定的方法选自吸附法、共价结合法、交联法和微胶囊法中的至少一种。

42、吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将细胞吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

43、共价结合法是利用细胞表面的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。

44、交联法是采用双功能或多功能试剂与细胞表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得细胞被固定。

45、包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化细胞。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将细胞与胶溶液混合，经造粒而成。

46、在本发明应用较佳的实施方式中，固定化细胞是活菌或死菌的固定化细胞。

47、第八方面，本发明还提供了p450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞在3-苯丙醇生物合成中的应用。

48、p450单加氧酶包括不限于纯化后的重组p450单加氧酶蛋白，含p450单加氧酶的粗酶液。

49、采用上述p450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞能够高效、快速、简便的在常温、常压及水相环境中实现3-苯丙醇生物合成，整个合成过程对环境友好，具有广阔的应用前景。

50、在本发明应用较佳的实施方式中，3-苯丙醇生物合成的底物为苯丙烷。

51、第九方面，本发明还提供了一种生物合成3-苯丙醇的方法，采用上述的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞与底物反应。

52、在本发明应用较佳的实施方式中，反应的温度是25-35℃；反应温度例如是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或上述任意两两温度之前的任一点值。在上述反应温度下，具有较高的3-苯丙醇生物合成效率。

53、在本发明应用较佳的实施方式中，每10-50mm的底物与5-25ml的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

54、例如每10-20mm、10-25mm、30-40mm或35-50mm的底物与5-10ml、15-25ml或20-25ml的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

55、在本发明应用较佳的实施方式中，将p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞置于缓冲液中，与底物混合后在200-250rpm摇床上进行反应。

56、在本发明应用较佳的实施方式中，将反应产物用有机溶剂进行萃取，经柱层析分析获得3-苯丙醇。在一种可选的实施方式中，上述有机溶剂选自容易与3-苯丙醇相容的有机溶剂，例如酯类、醇类。酯类例如乙酸乙酯。通过柱层析以获得纯化后的3-苯丙醇。

57、在本发明应用较佳的实施方式中，缓冲液为50mm浓度、ph 6-9的磷酸钠缓冲液。

58、本发明具有以下有益效果：

59、本发明提供了一种p450单加氧酶，该p450单加氧酶具有生物合成3-苯丙醇的功能。相对于现有的3-苯丙醇的制备方法，使用本发明提供的p450单加氧酶进行生物合成3-苯丙醇，具有反应速率高，耗时短的技术优势。

60、本发明提供的p450单加氧酶在合成3-苯丙醇时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和。

61、此外，本发明提供的p450单加氧酶在合成3-苯丙醇时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的p450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便，具有广阔的应用前景。