褐紫曲霉LZ7-24及其在提取收粉灵芝多糖中的应用的制作方法

(一)本发明属于微生物发酵，具体涉及一株褐紫曲霉lz7-24及其在提取收粉灵芝多糖中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、中药材灵芝，是多孔菌科(polyporaceae)真菌赤芝(ganoderma lucidum)或紫芝(ganoderma sinense)的干燥子实体，它具有重要的药用及营养保健价值，在我国药用历史已有2000多年。灵芝含有多种生物活性成分，包括多糖、三萜、多肽、核苷、甾醇、生物碱等，其中，最为关注的多糖和三萜，它们的含量是衡量灵芝品质的重要指标，如《中国药典》2020版一部中要求，中药材灵芝的多糖含量不得少于0.90％，三萜及甾醇(以齐墩果酸计)的含量不得少于0.50％。

2、近年来，随着灵芝食药价值的不断发掘，消费者对于灵芝类产品的追捧热情不断升温，灵芝栽培技术和深加工技术的迅速发展，灵芝孢子粉、灵芝糖浆、灵芝孢子油、灵芝浸膏等一系精深加工产品应运而生，且市场规模不断扩大。这些产品中，灵芝孢子粉因其功效显著而成为最受消费者青睐的产品，其占据灵芝类产品的40％以上，所以，以孢子粉为目标产品的灵芝栽培占其栽培总面积的一半以上。

3、灵芝孢子粉是在灵芝生长成熟之后，从灵芝菌盖下方自然弹射而出的孢子，业内习惯将产孢子为主要目的灵芝子实体称为“收粉灵芝”、“套袋灵芝”或“套筒灵芝”。收粉灵芝的生长期往往长达9-10个月，是普通灵芝栽培周期的3-5倍，在子实体不产孢子后即被拔除。由于收粉灵芝生长期长、纤维化程度高，活性成分含量低，不能作为药用灵芝使用，如用于提取多糖或三萜，但由于提取得率低，经济效益不佳，所以，收粉灵芝也逐渐沦落为灵芝孢子粉产业链上的低价值副产品，并随着孢子粉产业的不断发展和壮大，大量被拔除的收粉灵芝常常被种植户作为废弃物处理。

4、由此可见，大量的收粉灵芝因其经济附加值低，未能得到足够的重视和充分的利用，造成了潜在产业资源的浪费，若能开发出一套适用于收粉灵芝深加工的新技术，提升其经济价值，进一步释放灵芝产业的发展潜能，提高产业的经济效益，这对于收粉灵芝种植户的丰产增收和产业的节能减排均具有重要的现实意义。

5、灵芝中的多糖因其具有广泛的生理活性而备受关注，其具有免疫调节、辅助抗肿瘤、抗衰老、抗糖尿病、保护心脑血管，保肝解毒等作用，广泛应用于医疗、保健、化妆品行业。目前有较多关于从普通灵芝中提取多糖的研究报道，基本方法都是热水提取法，在此基础上，有采取超声波、微波和酶解等辅助措施提取，都能显著提高多糖提取得率。由于收粉灵芝纤维化程度高，用这些方法从收粉灵芝中提取多糖，对提高多糖提取得率效果不显著。

6、自然界中的植物残枝败叶都是靠微生物分解腐烂，这些微生物在生长过程中可以产生多种分解植物组织的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和果胶酶等。所以，如果用微生物直接发酵预处理收粉灵芝，只要控制好生长程度，达到产酶分解的灵芝细胞壁，从而促进灵芝多糖类物质在提取时溶出，得率就能得以提高。

7、为了能够开发利用收粉灵芝，克服从收粉灵芝提取多糖得率低的问题，本发明对收粉灵芝做微生物发酵预处理步骤，再采用热水超声提取，可使收粉灵芝多糖提取得率大幅度提高。

技术实现思路

0、(三)技术实现要素：

1、本发明目的是提供一株新的微生物菌株-褐紫曲霉(aspergillusbrunneoviolaceus)lz7-24及其在提取收粉灵芝多糖中的应用，收粉灵芝经该菌株发酵后，多糖提取得率可以显著提高。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一株用于提高收粉灵芝多糖提取率的新的微生物菌株-褐紫曲霉(aspergillus brunneoviolaceus)lz7-24，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号gdmcc no：64323，保藏日期2024年3月1日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

4、本发明所述褐紫曲霉lz7-24，是从收粉灵芝的微生物富集培养物中分离，经过筛选并诱变选育获得的优良菌株。所述褐紫曲霉lz7-24的形态特征如下：划线接种在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板培养基上，28℃培养24h后，接种线两侧长出灰白色菌丝，48h后，菌落呈褐紫色，表面产生大量褐色分生孢子，无渗出液，菌落背面浅黄色；分生孢子梗直立或稍弯曲，分生孢子头具有曲霉属霉菌典型的“菊花”状分生孢子头，呈球形或近球形，单层小梗；分生孢子近似球形或椭圆形，表面有放射状小刺，直径4-5μm。

5、所述褐紫曲霉lz7-24的核糖体dna内转录间隔区(ribosomal dna internaltranscribed spacer，rdna-its)核苷酸序列为seq id no.1所示。

6、本发明还提供一种所述褐紫曲霉lz7-24在提取收粉灵芝多糖中的应用，所述应用的方法包括以下步骤：(1)向收粉灵芝粉中加入褐紫曲霉lz7-24的孢子液和无菌蔗糖水溶液，搅拌均匀后于28-30℃发酵42-54h，获得收粉灵芝发酵物；(2)收粉灵芝发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35-40℃水浴保温0-6h，然后100℃浸提2-3h，再经超声提取后过滤，收集滤液，获得收粉灵芝水提液；(3)将收粉灵芝水提液浓缩至原体积的1/20-1/35，加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤，真空干燥后，获得收粉灵芝多糖提取物。

7、进一步，所述步骤(1)中的收粉灵芝是人工栽培的赤芝(ganoderma lucidum)，用于生产灵芝孢子粉结束后，经自然晾干的子实体；所述的收粉灵芝粉是收粉灵芝经85℃烘干12h，粉碎后过10目筛的粗粉。

8、进一步，所述步骤(1)中的褐紫曲霉lz7-24孢子液的制备方法为：低温保存的褐紫曲霉lz7-24孢子接种于pda平板培养基上，于28℃培养56-72h后，加无菌生理盐水于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液用无菌生理盐水调整孢子浓度为1×107-2×107个/ml。所述的pda平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/l的浓度配制，ph自然，高压蒸汽121℃灭菌20min。

9、进一步，所述步骤(1)中的褐紫曲霉lz7-24的孢子液体积用量以收粉灵芝粉质量计为2-3ml/g。

10、进一步，所述步骤(1)中的无菌蔗糖水溶液中蔗糖的浓度为20g/l，高压蒸汽121℃灭菌10min；无菌蔗糖水溶液体积用量以收粉灵芝粉质量计为2-4ml/g。

11、进一步，所述步骤(2)中的收粉灵芝水提液的制备方法为：收粉灵芝发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35-40℃保温4-6h，然后于100℃水浴中提取2-3h，再转入水温40-50℃的超声波清洗机中，100-150w超声提取45-75min，超声提取结束后，布氏漏斗抽滤，收集滤液，即为收粉灵芝水提液。所述的去离子水体积加入量以发酵前收粉灵芝粉质量计为35-40ml/g。

12、进一步，所述步骤(3)中的收粉灵芝多糖提取物的制备方法为：将收粉灵芝水提液于60℃、-0.1mpa条件下减压浓缩至原体积的1/20-1/35后，再加入浓缩液体积3-4倍的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数达到75％-80％，4℃条件下静置12-16h后，5000-8000r/min离心5-10min，收集沉淀物，沉淀物用原料收粉灵芝粉质量计1.5-2.0ml/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心后沉淀物于65℃、-0.1mpa条件下真空干燥至恒重，获得收粉灵芝多糖提取物。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选一株能够提高收粉灵芝多糖提取率的微生物菌株-褐紫曲霉lz7-24，该菌株是针对能够水解收粉灵芝细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。褐紫曲霉lz7-24在添加蔗糖的收粉灵芝中适度生长，产生多种水解酶，之后，经发酵的收粉灵芝加水保温，细胞壁中的纤维素和蛋白质等物质被水解，有助于结合态的多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高其提取得率。较不采用发酵预处理的直接提取相比，本发明在热水超声提取收粉灵芝多糖前，增加了微生物发酵预处理，收粉灵芝多糖提取得率可以提高119％，同时提高了作为废弃物的收粉灵芝的利用率。