一种新型多靶点辅助诊断甲状腺癌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及体外诊断，具体而言，涉及一种新型多靶点辅助诊断甲状腺癌的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、甲状腺癌是一种起源于甲状腺滤泡上皮或滤泡旁上皮细胞的恶性肿瘤，也是头颈部最为常见的恶性肿瘤。近年来，全球范围内甲状腺癌的发病率增长迅速，据全国肿瘤登记中心的数据显示，我国城市地区女性甲状腺癌发病率位居女性所有恶性肿瘤的第4位。我国甲状腺癌将以每年20％的速度持续增长。根据肿瘤起源及分化差异，甲状腺癌又分为：甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，ptc)、甲状腺滤(follicular thyroidcarcinoma，ftc)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，mtc)、甲状腺低分化癌(poorly differentiated thyroid carcinoma，pdtc)以及甲状腺未分化癌(anaplasticthyroid cancer，atc)，其中ptc最为常见，约占全部甲状腺癌的90％，而ptc和ftc合称分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma，dtc)。不同病理类型的甲状腺癌，在其发病机制、生物学行为、组织学形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面均有明显的不同。一般来说，dtc预后较好。atc的恶性程度极高，中位生存时间仅7～10个月，预后极差。mtc的预后居于两者之间。结节通常是甲状腺癌的最初表现，但在95％的情况下，它仅是一种增生或良性病变。因此，鉴于甲状腺癌的低死亡率和恶性甲状腺结节的低百分比，准确诊断病变将避免患者进行不必要的手术。

2、甲状腺结节大多通过细针穿刺活检(fine-needle aspiration，fna)进行诊断，尽管它们具有独特的细胞形态学特征，但对于恶性和良性滤泡性肿瘤的细胞学区分仍然很困难。fna可能由于获取较少的肿瘤细胞而被诊断为“不确定”，在这种情况下，通常会重复fna采样，或在某些情况下进行手术以尝试进行诊断，这些操作都会导致额外的发病率和更高的医疗费用。具有恶性肿瘤和不确定fna细胞学的患者通常接受有限手术，即肺叶切除，一旦通过切除结节的病理检查确认了恶性，这些患者必须进行第二次手术以完成甲状腺切除，这也导致了额外的发病率和费用。此外，在fna上被诊断为良性的结节中，1-3％在后续随访中被发现为恶性，治疗的延迟使患者面临疾病进展的风险。

3、fna样本进行分子检测可以显著提高甲状腺结节细胞学诊断的准确性，对临床护理产生重大影响。在ptc中，braf和ras基因的点突变最常见，而最常见的染色体重排是ret/ptc，它参与了丝裂原激活蛋白激酶(mapk)途径。这些突变在70％以上的ptc中被发现，并且是相互排斥的。ras突变或pax8/pparγ重排，它们是相互排斥的，约80％的ftc中被检测到。许多其他基因改变，例如pik3ca、pten、β-连环蛋白(ctnnb1)、tp53、akt和trk重排，也与甲状腺癌有关，但较为罕见。

4、明确诊断是肿瘤治疗的前提，超声及超声引导下的细针穿刺是甲状腺结节良恶性甄别的首选方法。国内通常将2017版bethesda系统(tbsrtc)作为甲状腺细胞病理诊断标准。根据诊断标准，细胞学分别诊断为标本无法诊断、良性病变、意义不明确的细胞不典型病变/滤泡性病变(aus/flus)、滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤(fn/sfn)、可疑恶性肿瘤和恶性肿瘤六大类型。其中，ⅲ至ⅴ类不确定的诊断给临床带来巨大挑战，因为良恶性诊断决定了甲状腺结节管理方案如何制定。近年来，基因检测在协助甲状腺结节良恶性诊断方面受到广泛关注。根据我国甲状腺癌诊疗指南(2022版)，经细针抽吸仍不能确定良恶性的甲状腺结节，可对穿刺标本进行分子标记物检测，如braf突变、ras突变、ret/ptc重排等，有助于提高确诊率。检测术前穿刺标本的braf突变状况，还有助于甲状腺乳头状癌的诊断和临床预后预测，便于制订个体化的诊治方案。

5、在本专利中，我们采用了一种新的优化程序进行分子分析，该程序涉及在易于获取的fna样本中检测braf、hras、nras、tert基因突变和ccdc6-ret基因融合的一系列步骤，以提高对甲状腺结节的fna诊断的效力，从而改善患者管理。

技术实现思路

1、本发明利用多重pcr技术，旨在同时检测甲状腺结节fna样本中的基因突变和基因融合，为甲状腺癌的准确诊断提供一种有效的产品。其主要难点在于：首先，甲状腺结节良恶性相关的基因突变位点繁多，部分位点含有高gc含量或高重复序列，这增加了引物设计的难度。其次，在多重pcr反应中，不同引物间的相互干扰也是一个问题，可能导致某些引物的扩增性能不足。此外，甲状腺结节细针穿刺活检样本数量有限，从这些样本中提取的核酸量往往不足以进行多个基因位点的全面检测，这也是目前应用中的一个主要难点。

2、为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供基于多重pcr法的甲状腺癌辅助诊断相关多靶点检测的试剂盒及其应用。

3、为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

4、一方面，本发明提供了一种用于消除甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断中的非特异性扩增的pcr添加剂，pcr添加剂包括三氮唑。

5、所述pcr添加剂用于使pcr反应耐受高浓度野生型细胞系dna，而不产生非特异性扩增。

6、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t、tert基因c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

7、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的靶点为所述的5种基因突变和1种基因融合。

8、进一步的，所述三氮唑的浓度为1.2m～1.4m。

9、另一方面，本发明提供了一种用于甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的产品，所述产品包括试剂盒、芯片、膜条或检测系统中的任意一种；所述产品还包括pcr添加剂，pcr添加剂包括三氮唑。

10、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的诊断靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

11、进一步的，所述产品还包括检测物，检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针，具体如下：

12、

13、

14、另一方面，本发明提供了一种pcr添加剂用于制备消除甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断中的pcr反应在高浓度野生型细胞系dna下的非特异性扩增的试剂的用途，pcr添加剂包括三氮唑。

15、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

16、另一方面，本发明提供了一种pcr添加剂用于在制备甲状腺癌辅助诊断产品中的用途，所述pcr添加剂包括三氮唑，所述甲状腺癌辅助诊断产品包括试剂盒、芯片、膜条或检测系统中的任意一种，所述甲状腺癌辅助诊断的靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

17、另一方面，本发明提供了一种用于甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的引物组合，包括如下所示的引物、探针组合的一组或多组：

18、 位点 靶序列 正向引物 反向引物 探针 braf v600e seq id no.1 seq id no.2 seq id no.3 seq id no.4 tert c228t seq id no.5 seq id no.6 seq id no.8 seq id no.9 tert c250t seq id no.5 seq id no.7 seq id no.8 seq id no.9 nras q61r seq id no.10 seq id no.11 seq id no.12 seq id no.13 hras q61r seq id no.14 seq id no.15 seq id no.16 seq id no.17 actb基因突变内参基因 seq id no.18 seq id no.19 seq id no.20 seq id no.21 ccdc6-ret seq id no.22 seq id no.23 seq id no.24 seq id no.25 actb基因融合内参基因 seq id no.26 seq id no.27 seq id no.28 seq id no.29

19、另一方面，本发明提供了一种用于甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的产品，所述产品包括试剂盒、芯片、膜条或检测系统中的任意一种；包括所述的引物组合。

20、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

21、进一步的，所述甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的靶点为所述的5种基因突变和1种基因融合。

22、进一步的，所述产品还包括pcr添加剂，pcr添加剂包括三氮唑。

23、进一步的，所述三氮唑的浓度为1.2m～1.4m。

24、另一方面，本发明提供了一种诊断靶点组合用于制备甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的试剂的用途，所述靶点包含5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

25、进一步的，所述试剂包括诊断靶点的引物组合，所述引物组合包括如下所示的引物、探针组合的一组或多组：

26、 位点 靶序列 正向引物 反向引物 探针 braf v600e seq id no.1 seq id no.2 seq id no.3 seq id no.4 tert c228t seq id no.5 seq id no.6 seq id no.8 seq id no.9 tert c250t seq id no.5 seq id no.7 seq id no.8 seq id no.9 nras q61r seq id no.10 seq id no.11 seq id no.12 seq id no.13 hras q61r seq id no.14 seq id no.15 seq id no.16 seq id no.17 actb基因突变内参基因 seq id no.18 seq id no.19 seq id no.20 seq id no.21 ccdc6-ret seq id no.22 seq id no.23 seq id no.24 seq id no.25 actb基因融合内参基因 seq id no.26 seq id no.27 seq id no.28 seq id no.29

27、另一方面，本发明提供了一种引物组合用于制备甲状腺结节良恶性判别辅助甲状腺癌诊断的试剂的用途，所述引物组合包括如下所示的引物、探针组合的一组或多组：

28、 位点 靶序列 正向引物 反向引物 探针 braf v600e seq id no.1 seq id no.2 seq id no.3 seq id no.4 tert c228t seq id no.5 seq id no.6 seq id no.8 seq id no.9 tert c250t seq id no.5 seq id no.7 seq id no.8 seq id no.9 nras q61r seq id no.10 seq id no.11 seq id no.12 seq id no.13 hras q61r seq id no.14 seq id no.15 seq id no.16 seq id no.17 actb基因突变内参基因 seq id no.18 seq id no.19 seq id no.20 seq id no.21 ccdc6-ret seq id no.22 seq id no.23 seq id no.24 seq id no.25 actb基因融合内参基因 seq id no.26 seq id no.27 seq id no.28 seq id no.29

29、进一步的，所述试剂的诊断靶点包括5种基因突变和1种基因融合中的至少一种；所述5种基因突变选自braf基因v600e、tert基因c228t/c250t、nras基因q61r、hras基因q61r，所述基因融合选自ccdc6-ret(exon1-exon12)。

30、进一步的，所述试剂还包括pcr添加剂，pcr添加剂包括三氮唑。

31、进一步的，所述三氮唑浓度为1.2m～1.4m。

32、本发明具有如下有益效果：

33、1、本发明基于多重pcr法的甲状腺结节良恶性相关多基因检测引物组合，可同时检测多个基因突变位点，检测成本更低。同时本发明的靶点覆盖了中国人群的甲状腺癌基因热点突变位点以及基因融合区域，检测位点更全面，灵敏度更高；

34、2、本发明针对甲状腺结节良恶性诊断中最重要的基因热点突变位点，并结合融合区域进行检测。这为甲状腺结节的良恶性鉴别提供了卓越的辅助诊断效果。在实际应用中，表现出极高的诊断灵敏度、特异性和准确性，从而为临床医生在判断甲状腺结节良恶性时提供有力支持。特别是对于那些常规病理手段无法明确判断的患者，本产品的检测结果可以显著提升临床医生的诊断准确性和后续治疗方案的选择；

35、3、本发明针对pcr反应体系进行了优化，通过添加pcr添加剂苯扎溴铵、三氮唑，可保证基因突变的有效检出，同时可以耐受100ng高浓度野生型背景dna而不至于产生非特异性信号，不损失检测灵敏度，进一步提升了检测结果的准确性以及产品的检测性能。