一种基于双重RAA-LFD技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的引物组、试剂盒及方法

本发明涉及分子生物学检测，具体地涉及水产品中食源性寄生虫的检测，更具体地涉及一种针对简单异尖线虫和典型异尖线虫its序列设计的特异性引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、简单异尖线虫(anisakis simplex)和典型异尖线虫(anisakis typica)能引起食源性人兽共患寄生虫病，广泛分布于世界各地的海洋硬骨鱼类中，潜在致病性不容忽视。当人类食用了含简单异尖线虫和典型异尖线虫的宿主鱼，就可能感染异尖线虫病。患者主要表现为胃肠综合症，包括急性的腹痛、皮肤瘙痒、恶心和呕吐等症状。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食文化更加多元化，生食海鲜风气的盛行以及海鱼异尖线虫感染率的上升，异尖线虫病每年呈现逐渐增加的态势，由简单异尖线虫和典型异尖线虫引发的异尖线虫病已成为一个新兴的公共卫生难题。因此，对简单异尖线虫和典型异尖线虫进行快速、准确的检测，是有效控制其流行和传播的前提，能够减少渔业的经济损失，保障消费者的健康。

2、目前，水产品中简单异尖线虫和典型异尖线虫的检测标准是《sc/t7210-2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法》，主要通过肉眼观察寄生虫形态，并根据其头部、消化道、尾部的结构特征进行判断。但不同生长阶段的异尖线虫幼虫形态和结构存在显著差异，仅凭形态学方法很难做出确定性判断。此后，结合形态学鉴定、pcr扩增和测序确定是否是简单异尖线虫和典型异尖线虫。虽然这种方法提供了鉴定虫种的标准，但需要将样品送往测序公司，耗时耗力，且需要昂贵的仪器，难以推广应用到基层单位。近年来等温扩增技术发展趋于成熟，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)等多种等温扩增技术被应用于简单异尖线虫和典型异尖线虫检测，lamp法只需在63～66℃扩增45～60min。但lamp检测对引物的要求特别高，需根据6个区域设计4对引物，引物设计过程繁琐，难度大。

3、重组酶介导等温扩增技术(recombinase aided amplification，raa)引物设计简单，可以在较低温度(35～40℃)与较短时间内完成解链、配对、延伸等过程，该技术所用的重组酶来源广泛，而且是具有我国自主知识产权的一项技术，不受国外专利的限制。将raa技术与侧流层析试纸条技术(lateral flow dipstick，lfd)相结合，利用试纸条可以将raa反应结果可视化。目前，raa-lfd已成功应用于病原菌、病毒、真菌和转基因等的快速检测，实现了野外等偏远地区的现场诊断。然而，目前尚未开发双重raa-lfd法用于同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术检测方法的不足，建立一种基于双重raa-lfd技术、能够同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，以实现在基层等资源有限的环境中快速、特异、准确地检测简单异尖线虫和典型异尖线虫。

2、为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：

3、本发明的第一方面，是提供一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的引物组，包括两组引物；

4、其第一组引物用于特异性扩增简单异尖线虫：

5、上游引物as-f：5'-ctaatcatcattgatgagcagtagcttaagg-3'(seq id no.1)；

6、下游引物as-r：5'-catacaatgaaataacaatgtcaaatagaccgg-3'(seq id no.2)；

7、其第二组引物用于特异性扩增典型异尖线虫：

8、上游引物m-at-f:ttgggtgtgatcttgctggtcacaaaagtgcc(seq id no.3)；

9、下游引物at-r:5'-ctgagctgaggtcaaatacg-3'(seq id no.4)；

10、其中，as-f的5’端为荧光素标记，as-r的5’端为生物素标记，m-at-f的5’端为地高辛标记，at-r的5’端为生物素标记。

11、本发明的第二方面，是提供一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。

12、进一步地，所述试剂盒还包括raa反应试剂和侧流层析试纸条。

13、进一步地，所述raa反应试剂包括缓冲液、醋酸镁溶液、ddh2o，均为可购买到的用于raa反应的常规试剂。

14、进一步地，所述侧流层析试纸条具有t1检测线、t2检测线和质控线(c)；所述t1检测线上标记有抗地高辛的抗体，用于捕获典型异尖线虫的扩增产物；所述t2检测线上标记有抗荧光素的抗体，用于捕获简单异尖线虫的扩增产物；所述质控线上标记有生物素的配体。

15、本发明的第三方面，是提供一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，具体是利用上述试剂盒按照以下步骤进行检测：提取待测样本的dna，将其与所述引物组和所述raa反应试剂混合后，进行raa反应，得到扩增产物，采用所述侧流层析试纸条对所述扩增产物进行检测。

16、进一步地，所述raa反应的条件为：35-39℃，15min。更优选为37℃，15min。

17、本发明具有以下有益效果：

18、1、双重raa-lfd技术的双重特异性引物，经过序列改良后，不会出现因产生引物二聚体而导致假阳性结果的现象，特异性强，灵敏度高；

19、2、可实现同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫，操作简便；

20、3、双重raa-lfd技术具有高特异性，能在其他线虫和常见的食源性致病菌中准确地检出简单异尖线虫和典型异尖线虫；

21、4、灵敏度高，本发明的引物组合、试剂盒及方法，可以检测低至101fg/μl的简单异尖线虫和102fg/μl的典型异尖线虫；

22、综上所述，本发明提供的基于双重raa-lfd技术是一种可同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，对仪器设备要求低，在较低的反应温度如37℃下孵育15min便能完成扩增，其扩增产物通过lfd 15min检测后，结果肉眼可见，结果判定简单，可满足基层检测机构和现场检测的需要。

技术特征：

1.一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的引物组，其特征在于：包括两组引物；

2.一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的试剂盒，其特征在于：还包括raa反应试剂和侧流层析试纸条。

4.根据权利要求3所述的基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的试剂盒，其特征在于：所述raa反应试剂包括缓冲液、醋酸镁溶液、ddh2o。

5.根据权利要求3所述的基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的试剂盒，其特征在于：所述侧流层析试纸条具有t1检测线、t2检测线和质控线，所述t1检测线上标记有抗地高辛的抗体，所述t2检测线上标记有抗荧光素的抗体，所述质控线上标记有生物素的配体。

6.一种基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，其特征在于：是利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：提取待测样本的dna，将其与所述引物组和所述raa反应试剂混合后，进行raa反应，得到扩增产物，采用所述侧流层析试纸条对所述扩增产物进行检测。

7.根据权利要求6所述的基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，其特征在于：所述raa反应的条件为：35-39℃，15min。

8.根据权利要求7所述的基于双重raa-lfd技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的方法，其特征在于：所述raa反应的条件为：37℃，15min。

技术总结本发明属于分子生物学检测技术领域，具体公开了一种基于双重RAA‑LFD技术同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫的引物组、试剂盒及方法。本发明经碱基改良后的引物特异性强，可以同时准确地检测简单异尖线虫和典型异尖线虫。灵敏度高，可检测到低至10<supgt;1</supgt;fg/μL的简单异尖线虫和10<supgt;2</supgt;fg/μL的典型异尖线虫。在较低的反应温度37℃下反应15min便可完成检测，解决了传统病原学、PCR等检测方法周期长、依赖仪器设备、同时检测简单异尖线虫和典型异尖线虫难度大等问题。本发明检测方法对设备要求低，可满足基层检测机构和现场检测的需要，为简单异尖线虫和典型异尖线虫检测提供技术支撑，具有广泛的应用前景。技术研发人员：孙晓红,张妮,赵嘉怡,周梦晓受保护的技术使用者：上海海洋大学技术研发日：技术公布日：2024/8/5