分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒与流程

本发明涉及分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒。

背景技术：

1、利用基质辅助激光解吸电离(maldi)法等的质谱分析是用于解析肽等生物分子的强有力的手段。但是，通过maldi法等将试样电离时，在试样板上配置试样后，试样中的肽有时发生氧化。

2、试样板上的肽的氧化在试样中的分子的浓度低、或试样板中包含对氧化进行催化的铜作为杂质、或试样中的氧浓度高等情况下容易发生。发生这种试样板上的肽的氧化时，会错误分析而使得比本来的试样的氧化状态更多地进行了氧化。

3、特别是肽的主链中的甲硫氨酸残基与其它氨基酸残基相比容易受到氧化。这种甲硫氨酸残基的氧化中，在很多情况下，侧链的硫原子通过氧化而转化为亚砜型。

4、专利文献1中提出了以将蛋白质/肽试样中的含甲硫氨酸的化学种收敛为甲硫氨酸氧化体作为目的的方法。这种方法导致试样的氧化状态变化。非专利文献1中，为了提高质谱分析对胰岛素等3000da以上的高质量的肽的灵敏度，添加了牛血清白蛋白(bsa)、转铁蛋白等蛋白质，但没有记载抑制氧化的目的或效果。

5、现有技术文献

6、专利文献

7、专利文献1：日本特开2007-292523号公报

8、非专利文献

9、非专利文献1：gustavsson n,kokke bp,harndahl u,silow m,bechtold u,poghosyan z,murphy d,boelens wc,sundby c.“a peptide methionine sulfoxidereductase highly expressed in photosynthetic tissue in arabidopsis thalianacan protect the chaperone-like activity of a chloroplast-localized small heatshock protein,”the plant journal,(美国),society for experimental biology,2002年3月1日,volume 29,issue 5,pp.545-553

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、期望抑制质谱分析中的肽的甲硫氨酸的氧化的、高效率的方法。

3、用于解决问题的方案

4、根据本发明的第1方式，分析方法具备：制备包含分析对象的肽和用于防止甲硫氨酸的氧化的抗氧化剂的试样，所述抗氧化剂具备蛋白质；通过激光解吸电离法将所述肽电离；以及，将电离后的所述肽进行质量分离并检测。

5、根据本发明的第2方式，第1方式的分析方法中，所述激光解吸电离法优选为基质辅助激光解吸电离法。

6、根据本发明的第3方式，第1或第2方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选为27.5nm以上且不足275nm。

7、根据本发明的第4方式，第3方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选不足260nm。

8、根据本发明的第5方式，第4方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选为45.2nm以上且不足151nm。

9、根据本发明的第6方式，第1～第5中任一方式的分析方法中，所述抗氧化剂优选除了具备所述蛋白质之外还具备氨基酸和/或还原剂。

10、根据本发明的第7方式，第6方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、n-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。

11、根据本发明的第8方式，第6或第7方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂的浓度优选为0.001mm以上且10mm以下。

12、根据本发明的第9方式，第1或第2方式的分析方法中，优选的是，所述肽使用亲和纯化而进行了纯化，所述蛋白质为所述亲和纯化所使用的配体，所述分析方法具备：在所述亲和纯化中，在使用洗脱液将所述肽洗脱前、或洗脱后，在所述洗脱液中添加氨基酸和/或还原剂。

13、根据本发明的第10方式，第9方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、n-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。

14、根据本发明的第11方式，第9或第10方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂的浓度优选为0.0001mm以上且10mm以下。

15、根据本发明的第12方式，质谱分析用肽抗氧化剂用于防止甲硫氨酸的氧化，其包含蛋白质，用于通过激光解吸电离法将分析对象的肽电离的质谱分析中的试样的制备。

16、根据本发明的第13方式，第12方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述蛋白质的浓度优选为27.5nm以上且不足275nm。

17、根据本发明的第14方式，第12或第13方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，优选除了具备所述蛋白质之外还具备氨基酸和/或还原剂。

18、根据本发明的第15方式，第14方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、n-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。

19、根据本发明的第16方式，第12～第15中任一方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述激光解吸电离法优选为基质辅助激光解吸电离法。

20、根据本发明的第17方式，质谱分析用试剂盒具备第12～第16中任一方式的质谱分析用肽抗氧化剂、以及选自由试样板和基质组成的组中的至少一者。

21、发明的效果

22、根据本发明，能够高效抑制质谱分析中的肽的甲硫氨酸的氧化，比以往更准确地测定试样中的甲硫氨酸的氧化状态。

技术特征：

1.一种分析方法，其为以包含甲硫氨酸的肽为分析对象的分析方法，其具备：

2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述激光解吸电离法为基质辅助激光解吸电离法。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，该还原剂包含有机化合物。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度为27.5nm以上且不足275nm。

5.根据权利要求4所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度不足260nm。

6.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度为45.2nm以上且不足151nm。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂除了包含所述蛋白质之外还包含侧链具有被氧化部位的氨基酸，

8.根据权利要求7所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂除了包含所述蛋白质和所述氨基酸之外还包含还原剂，

9.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，

10.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，

11.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，

12.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，

13.根据权利要求12所述的分析方法，其中，所述还原剂为选自由二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、n-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。

14.根据权利要求12所述的分析方法，其中，所述还原剂的浓度为0.0001mm以上且10mm以下。

15.根据权利要求1～15中任一项所述的分析方法，其中，所述蛋白质为选自由牛血清白蛋白、转铁蛋白、胎球蛋白组成的组中的至少1种。

16.一种质谱分析用肽抗氧化剂，其为权利要求1～3中任一项所述的分析方法中使用的肽抗氧化剂，

17.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，该还原剂包含有机化合物。

18.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述蛋白质的浓度为27.5nm以上且不足275nm。

19.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，除了具备所述蛋白质之外还具备侧链具有被氧化部位的氨基酸，

20.根据权利要求19所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，除了包含所述蛋白质和所述氨基酸之外还包含还原剂，

21.根据权利要求16～20中任一项所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述激光解吸电离法为基质辅助激光解吸电离法。

22.根据权利要求16～21中任一项所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述蛋白质为选自由牛血清白蛋白、转铁蛋白、胎球蛋白组成的组中的至少1种。

23.一种质谱分析用试剂盒，其具备：

技术总结提供分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒。所述分析方法具备：制备包含分析对象的肽和用于防止甲硫氨酸的氧化的具备蛋白质的抗氧化剂的试样；通过激光解吸电离法将肽电离；以及，将电离后的肽进行质量分离并检测。技术研发人员：金子直树受保护的技术使用者：株式会社岛津制作所技术研发日：技术公布日：2024/8/16