一种特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的制备方法及应用

本发明属于电化学分析检测，具体涉及一种电化学发光传感器用于特异性检测三叶苷的方法。尤其涉及将水热法制备的n-cds封装在agmof中得agmof@n-cds复合材料，并将其滴涂在玻碳电极表面，制得agmof@n-cds/gce，即以agmof@n-cds/gce为传感元件构建电化学发光传感器定量特异性检测三叶苷。

背景技术：

1、传统检测三叶苷的方法主要包括：高效液相色谱(hplc)、核磁共振波谱(nmr)、高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)等。但是这些方法存在一些不足，如：仪器设备昂贵，检测成本较高；操作复杂，需要专业人员操作；检测时间较长。因此，建立一种简便、快速、灵敏检测三叶苷的方法具有较高的应用价值。

2、目前，鲜有采用电化学发光法检测三叶苷的报道，基于电化学发光法的优势，构建电化学发光传感器用于检测三叶苷是一个较佳的新途径。构建灵敏电化学发光传感器的成功与否关键在于是否具有优异的发光体。氮掺杂碳量子点(n-cds)作为一种无毒、高量子产率、生物相容性佳的零维碳基发光材料，且其表面存在氨基基团，与三叶苷分子中的羟基基团存在氢键作用，用作构建电化学发光传感器的发光体。但是，由于其较强的水溶解性特征，在水系电解液中测试时稳定性较差，需进一步改善稳定性，使其可以稳固在电极上。

3、银基金属有机框架(agmof)是由ag+和1,3,5-苯三甲酸合成的mofs材料，其合成方法较为简易，耗时较短且只需在室温下进行不需要加热条件，且agmof自身也具备一定的电化学发光性能和较佳的催化活性。因此，在制备agmof时通过掺入n-cds，使得n-cds能够封装在agmof中以制得agmof@n-cds复合材料。基于agmof@n-cds复合材料作发光体构建电化学发光传感器，比表面积较大、孔隙率较高的agmof可以封装更多的n-cds，有效提高了材料的电化学发光稳定性；催化活性较佳的agmof与氮掺杂碳量子点(n-cds)的复合，进一步增强了材料的电化学发光响应，使得构建的传感器具备较高的灵敏度。此外，agmof@n-cds中封装的n-cds含有氨基基团与三叶苷分子中的羟基基团存在氢键作用，且agmof@n-cds与三叶苷之间存在静电吸附作用，使得该电化学发光传感器可以选择性检测三叶苷。公开的中国专利cn117233229a，其基于g-c3n4@nimof构建分子印迹电化学发光传感器检测三叶苷，具有较低的检限，但是分子印迹过程包括单体的聚合、模板分子的印迹、模板的洗脱以及再次特异性吸附等过程，制备过程较为复杂周期长，而且制备需消耗大量的三叶苷标准品，成本较高；同时该传感器检测三叶苷需先进行三叶苷的特异性富集，该过程需一定的时长才能达到电极的吸附平衡，吸附完成后再进行定量分析，操作相对繁琐且耗时长。本发明方法可以预先制备及储存agmof@n-cds修饰电极的材料，测试时仅需将该修饰电极材料滴涂到玻碳电极表面即可完成用于选择性检测三叶苷传感器的制备。本发明检测三叶苷仅需将制备的传感器置于少量待测液中直接测试，传感器响应度高，检测速度快整个检测过程2-5min以内即可，该传感器制备过程简单便捷，构建成本较低，适合大规范应用。此外，专利cn117233229a是基于分子印迹技术来检测三叶苷，而本发明是基于agmof@n-cds与三叶苷之间的氢键和静电吸附双重作用来实现特异性检测三叶苷，特异性识别率更高，速度更快。

4、本发明通过在裸gce表面滴涂agmof@n-cds分散液，在红外等下干燥后，得到agmof@n-cds/gce。采用三电极体系，以agmof@n-cds/gce作为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，构建电化学发光传感器，并测试agmof@n-cds/gce传感器检测三叶苷的性能。该传感器具有操作简便、稳定性好、分析速度快、选择性佳、成本低、灵敏度高等优点，是特异性定量分析三叶苷的一种有效新途径。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的制备方法，第二个目的是提供一种特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的应用方法。

2、本发明的第一个目的的制备方法是以agmof@n-cds/gce作为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，组成三电极体系。基于agmof@n-cds/gce检测三叶苷前后的ecl响应，实现对三叶苷的灵敏选择性定量检测，该传感器具有操作简易、检测范围宽、检测速度快、选择性佳、成本低、灵敏度高、方便携带等优点。

3、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

4、本发明提供的特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的制备方法，工作电极为agmof@n-cds/gce，基于agmof@n-cds/gce构建电化学发光传感器检测三叶苷。

5、进一步的，所述agmof@n-cds/gce电化学发光传感器的制备方法是：将玻碳电极抛光，依次用无水乙醇和去离子水超声清洗，室温下吹干，得洁净的玻碳电极，备用；用微量注射器移取agmof@n-cds的dmf分散液修饰在前处理后的玻碳电极表面，在红外灯下干燥，得到agmof@n-cds/gce。

6、进一步的，所述agmof@n-cds的制备方法的操作步骤：

7、s1.将尿素和柠檬酸溶于去离子水中，使其形成均匀溶液后，将混合溶液移至反应釜中，180℃反应，反应完成后，冷却至室温，离心，透析纯化后，冷冻干燥得n-cds；

8、其中，尿素与柠檬酸的质量比为1:1～1:6；反应时间为1～8h。该氮掺杂碳量子点(n-cds)是一种无毒、高量子产率、生物相容性佳的零维碳基发光材料，且其表面的氨基化基团，与三叶苷分子中的羟基基团可以形成牢固的氢键结合，具有较强的ecl强度的同时，又可以选择性识别三叶苷分子。

9、s2.将1,3,5-苯三甲酸溶解在乙醇中，得溶液a；硝酸银溶解在去离子水中，得溶液b；将溶液a和溶液b混合并加入制备的n-cds粉末，25℃搅拌反应，反应完成后，离心，乙醇洗涤后，60℃真空干燥12h，得agmof@n-cds；

10、其中，1,3,5-苯三甲酸、硝酸银与n-cds的质量比为10:10:1～100:100:1，反应时间为0.5～5h。

11、所用的玻碳电极的直径为3mm；所述agmof@n-cds的dmf分散液的浓度为0.5～3.0mg/ml，滴涂量为2.5～10μl。

12、本方案制备的agmof具有比表面积较大、孔隙率高的特点，可以将n-cds封装于以ag+为中心的有机框架之中，可以有效解决n-cds在水体系中的溶解而造成的ecl不稳定的现象。同时利用ag+的催化作用进一步激发agmof与n-cds的协同效果，进一步增强ecl性能。agmof@n-cds中封装的n-cds含有氨基基团与三叶苷分子中的羟基基团存在氢键作用，且agmof@n-cds与三叶苷之间存在静电吸附作用，使得该电化学发光传感器可以灵敏稳定地选择性定量检测三叶苷。

13、本发明的第二个目的是提供的一种特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的应用方法，具有同样的效果。

14、本发明的上述技术效果是由以下技术方案实现的：

15、本发明提供的一种特异性检测三叶苷的电化学发光传感器的应用方法，以agmof@n-cds/gce作为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，在三电极体系下，通过电化学发光法在含不同浓度三叶苷的电解液溶液中的电化学发光强度，定量检测三叶苷。

16、作为上述技术方案的优选，其具体步骤如下：

17、a1.含不同浓度三叶苷标准溶液的配制：

18、采用含0.05m过硫酸钾的ph 7.0的0.1m pbs缓冲溶液将三叶苷标准品配制成浓度为1×10-3m溶液，并稀释一系列不同浓度的三叶苷标准溶液，浓度范围为1×10-7～1×10-3m；

19、a2.标准曲线的绘制：

20、将agmof@n-cds/gce作为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，构成三电极体系，以含0.05m的k2s2o8的ph 7.0的0.1m pbs缓冲液作为空白溶液检测电化学发光强度，然后再将其置于步骤a1所制备的一系列不同浓度三叶苷标准溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电化学发光强度-时间曲线(ecl-time)，建立传感器检测三叶苷前后的发光强度差值与三叶苷浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

21、a3.实际样品检测：

22、取三叶苷粗提液用含0.05m的k2s2o8的ph 7.0的0.1mpbs缓冲溶液稀释，得待测样品，采用标准加入法对实际样品中的三叶苷进行电化学发光测试，按上述a2所得的线性回归方程计算出待检测样品中三叶苷的浓度。

23、作为上述技术方案的优选，三叶苷的检测范围为1×10-7～1×10-3m，最低检测限为6.0×10-8m。

24、综上所述，本发明具有以下有益效果：

25、本发明基于agmof@n-cds复合材料构建的电化学发光传感器，n-cds与agmof复合使得n-cds能够封装在agmof中，有效减小了n-cds修饰在gce上在水系电解液中的检测时的溶解、脱落情况，提高了材料的稳定性；以ag+为中心的agmof具有较强的催化性能，进一步激发了ecl性能，提高了传感器的灵敏度；agmof@n-cds中封装的n-cds中含氨基基团与三叶苷中的羟基基团存在氢键作用，复合材料agmof@n-cds与三叶苷之间存在静电吸附作用，使得传感器可以选择性检测三叶苷。

26、本发明提出的灵敏的电化学发光方法选择性检测三叶苷，其可以取代设备成本高、检测周期长的高效液相色谱、核磁共振等传统方法，具有操作简便、检测速度较快、线性范围较宽、选择性较佳、成本低、灵敏度较高等优点，推进了电化学发光传感器在检测三叶苷方面的应用。