结核疫苗的制作方法

背景技术：

1、结核仍然是全球疾病和死亡的主要原因(schito，m等人perspectives onadvances in tuberculosis diagnostics，drugs，and vaccines.clin infect dis.61suppl 3，s102-118(2015))。因此，仍然需要有效的针对结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)感染的预防性或治疗性疫苗。

2、研究发现，基于巨细胞病毒(cmv)的疫苗载体对所递送的抗原产生强烈的免疫应答，即使对于传统上能够逃避自然免疫并导致反复或慢性感染的病原体也是如此。例如，经过修饰以编码猿猴免疫缺陷病毒(siv)抗原的恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)68-1菌株与抵抗siv攻击的持久保护相关联(hansen，sg等人，immune clearance of highly pathogenicsiv infection.nature 502，100-104(2013)；hansen，sg等人，profound early controlof highly pathogenic siv by an effector memory t-cell vaccine.nature 473，523-527(2011)；hansen，sg等人，effector memory t cell responses are associated withprotection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency viruschallenge.nat med.15，293-299(2009))。随后对cmv载体的研究表明，根据cmv骨架的特定遗传组分，可能会引起不同的免疫应答(früh，k等人，cd8+ t cell programming bycytomegalovirus vectors：applications in prophylactic and therapeuticvaccination.curr opin immunol.47，52-56(2017)；hansen，sg等人cytomegalovirusvectors violate cd8+ t cell epitope recognition paradigms.science 340，1237874(2013))。

3、恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)的68-1已被证明引起cd8+ t细胞，该细胞识别由mhc-ii和mhc-e(而非常规的mhc-i)呈递的肽。在食蟹猴cmv(cycmv)中也观察到了这种效应，这证明hcmv ul128、ul130、ul146和ul147的rhcmv和cycmv同源物的缺失能够诱导mhc-e限制性cd8+ t细胞(国际申请公开号wo2016/130693a1、wo2018/075591a1)。另外，这些载体引起mhc-ii限制性cd8+ t细胞。通过将内皮细胞特异性微rna(mir)126的靶向位点插入到这些载体的必需病毒基因中，可以消除对mhc-ii限制性cd8+ t细胞的诱导，从而产生专门引起mhc-e限制性cd8+ t细胞的“仅mhc-e”载体(国际申请公开号wo2018/075591a1)。相比之下，将骨髓细胞特异性mir142-3p插入到68-1 rhcmv中已被证明防止对mhc-e限制性cd8+ t细胞的诱导，从而产生引起专门受mhc-ii限制的cd8+ t细胞的载体(国际申请公开号wo2017/087921a1)。ul40同源物rh67的缺失也被证明防止对mhc-e限制性cd8+ t细胞的诱导，从而产生“仅mhc-ii的载体”(国际申请公开号wo2016/130693a1)。因此，通过设计具有特定基因缺失的cmv载体，cmv可用于递送抗原并“编程”针对这些抗原的免疫应答。

技术实现思路

1、本文公开了包含结核分枝杆菌(mtb)抗原的融合蛋白和编码这些融合蛋白的核酸。在一些实施例中，本公开提供了一种融合蛋白，其包含mtb ag85a、esat-6、rv3407、rv2626c、rpfa、rpfd、ra12、tbh9和ra35或其部分或片段中的一者或多者。在一些实施例中，本公开提供了编码如上所述的融合蛋白的载体。

技术特征：

1.一种融合蛋白，其包含以下项或由以下项组成：

2.一种融合蛋白，其由核酸编码，所述核酸包含与根据seq id no：41的核酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

3.一种融合蛋白，其由核酸编码，所述核酸包含根据seq id no：41的核酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含多聚his标签。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述多聚his标签包含二至六个his残基或由二至六个his残基组成。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述多聚his标签位于所述融合蛋白的n末端。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述多聚his标签插入在初始met残基之后。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含ha标签。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述ha标签位于所述融合蛋白的c末端。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含连接ag85a、esat-6、rv3407、rv2626c、rpfa、rpfd、ra12、tbh9和ra35中的一者或多者的一个或多个接头，其中所述一个或多个接头中的每一个接头包含一个或多个氨基酸残基或由一个或多个氨基酸残基组成。

11.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白。

12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸分子。

13.根据权利要求12所述的载体，其进一步包含启动子，其中启动子可操作地连接至编码所述融合蛋白的所述核酸分子。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的载体，其中所述载体为病毒载体。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体为巨细胞病毒(cmv)载体。

16.一种载体，其包含与根据seq id no：44的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。

17.一种载体，其包含根据seq id no：44的核酸序列。

18.一种载体，其基本上由根据seq id no：44的核酸序列组成。

19.一种载体，其由根据seq id no：44的核酸序列组成。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的载体，其中所述病毒载体为rhcmv载体、hcmv载体或重组hcmv载体。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的载体，其中所述启动子可操作地连接至编码所述融合蛋白的所述核酸分子，并且所述启动子为ul78启动子或其直系同源物。

22.根据权利要求21所述的载体，其中编码所述融合蛋白的所述核酸分子替换全部或部分ul78。

23.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体包含与根据seq id no：44的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。

24.根据权利要求15或权利要求20所述的载体，其中所述启动子可操作地连接至编码所述融合蛋白的所述核酸分子，并且所述启动子为ul82启动子或其直系同源物。

25.根据权利要求24所述的载体，其中编码所述融合蛋白的所述核酸分子替换全部或部分ul82。

26.根据权利要求15至25中任一项所述的载体，其中所述rhcmv载体或hcmv载体不表达ul128或ul130或其直系同源物。

27.一种重组hcmv载体，其包含tr3骨架和根据seq id no：42的编码异源抗原的核酸序列，其中：

28.根据权利要求27所述的重组hcmv载体，其中所述重组

29.根据权利要求15至28中任一项所述的载体，其中所述rhcmv或hcmv载体(i)包含编码ul146的核酸序列和编码ul147或其直系同源物的核酸序列；并且(ii)不表达ul128或ul130或其直系同源物。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的载体，其中由于编码ul128和ul130的核酸序列中存在一个或多个突变，所述载体不表达ul128蛋白或ul130蛋白。

31.根据权利要求30所述的载体，其中编码ul128和ul130的所述核酸序列中的所述突变是点突变、移码突变、截短突变或编码病毒蛋白的整个核酸序列的缺失。

32.根据权利要求15至31中任一项所述的载体，其中所述载体为包含tr3骨架的hcmv载体。

33.根据权利要求15至32中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含编码微rna(mirna)识别元件(mre)的核酸序列，其中所述mre含有在内皮细胞中表达的mirna的靶位点。

34.根据权利要求15至33中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含编码mre的核酸序列，其中所述mre含有在骨髓细胞中表达的mirna的靶位点。

35.一种药物组合物，其包含(i)(a)根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白、(b)根据权利要求11所述的核酸、或(c)根据权利要求12至34中任一项所述的载体；以及(ii)药学上可接受的载体。

36.一种免疫原性组合物，其包含(i)(a)根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白、(b)根据权利要求11所述的核酸、或(c)根据权利要求12至34中任一项所述的载体；以及(ii)药学上可接受的载体。

37.一种在受试者中产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物。

38.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物在制造用于在受试者中产生免疫应答的药物中的用途。

39.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于在受试者中产生免疫应答。

40.一种治疗或预防受试者的结核的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物。

41.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物在制造用于治疗或预防受试者的结核的药物中的用途。

42.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核。

43.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者呈cmv阳性。

44.根据权利要求1至36中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者呈cmv阴性。

45.根据权利要求1至36、43或44中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者在干扰素-γ释放测定中测试呈阳性。

46.根据权利要求1至36、43或44中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者在干扰素-γ释放测定中测试呈阴性。

47.根据权利要求1至36或43至46中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者先前已施用卡介苗(bcg)。

48.根据权利要求1至36或43至47中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者呈hiv阳性。

49.根据权利要求1至36或43至48中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中所述受试者呈hiv阳性并且目前正在服用抗逆转录病毒治疗剂。

50.根据权利要求1至36或43至49中任一项所述的融合蛋白、核酸、载体或组合物，其用于治疗或预防受试者的结核，其中向所述受试者施用第二疗法。

51.根据权利要求40至50中任一项所述的方法、在制造中的用途或用途，其中所述结核为潜伏性结核感染。

52.根据权利要求40至51中任一项所述的方法、在制造中的用途或用途，其中所述结核为肺结核感染。

53.根据权利要求40至52中任一项所述的方法、在制造中的用途或用途，其中所述结核为复发性结核感染。

54.根据权利要求37至53中任一项所述的方法、在制造中的用途或用途，其中所述载体为cmv载体并且所述cmv载体以有效引起针对mtb抗原的cd4+t细胞应答的量施用。

55.根据权利要求54所述的方法、在制造中的用途或用途，其中由所述重组hcmv载体引起的cd4+t细胞中至少10％受mhc-ii或其直系同源物的限制。

56.根据权利要求55所述的方法、在制造中的用途或用途，其中由所述重组hcmv载体引起的cd4+t细胞中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％受mhc-ii或其直系同源物的限制。

57.根据权利要求37至56中任一项所述的方法、在制造中的用途或用途，其中所述载体为cmv载体并且所述cmv载体以有效引起针对mtb抗原的cd8+t细胞应答的量施用。

58.根据权利要求57所述的方法、在制造中的用途、或供使用的载体或组合物，其中由所述cmv载体引起的cd8+t细胞中至少10％受mhc-ia或其直系同源物的限制。

59.根据权利要求58所述的方法、在制造中的用途、或供使用的载体或组合物，其中由所述cmv载体引起的cd8+t细胞中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％受mhc-ia或其直系同源物的限制。

60.一种产生识别mhc-ii/肽复合物的cd4+t细胞的方法，所述方法包括：

61.一种产生识别mhc-ii/肽复合物的cd4+t细胞的方法，所述方法包括：

62.一种产生识别mhc-ia/肽复合物的cd8+t细胞的方法，所述方法包括：

63.一种产生识别mhc-ia/肽复合物的cd8+t细胞的方法，所述方法包括：

64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中所述第一cd4+tcr或所述第一cd8+tcr是通过dna或rna测序鉴定的。

65.根据权利要求60至64中任一项所述的方法，其中编码所述第二cd4+tcr的所述核酸序列或编码所述第二cd4+tcr的所述核酸序列与编码所述第一cd4+tcr或所述第一cd8+tcr的所述核酸序列相同。

66.根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中所述第一受试者是人。

67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述第二受试者是人。

68.一种通过根据权利要求60、61和64至67中任一项所述的方法产生的cd4+t细胞。

69.一种治疗或预防受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求68所述的cd4+t细胞。

70.根据权利要求68所述的cd4+t细胞在制造用于治疗或预防受试者的疾病的药物中的用途。

71.根据权利要求68所述的cd4+t细胞，其用于治疗或预防受试者的疾病。

72.一种通过根据权利要求62至67中任一项所述的方法产生的cd8+t细胞。

73.一种治疗或预防受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求72所述的cd8+t细胞。

74.根据权利要求72所述的cd8+t细胞在制造用于治疗或预防受试者的疾病的药物中的用途。

75.根据权利要求72所述的cd8+t细胞，其用于治疗或预防受试者的疾病。

技术总结本公开涉及结核抗原和用于递送所述抗原的载体。本公开还涉及包含所述抗原和载体的免疫原性组合物及其用途。技术研发人员：A·M·阿尔文,J·迪尤利奥,J·L·道格拉斯,E·马歇尔,L·B·索里亚加,H·W·维京受保护的技术使用者：维尔生物科技公司技术研发日：技术公布日：2024/8/20