标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白及其应用。

背景技术：

1、泛素是由76个氨基酸组成的球状蛋白，广泛存在于真核生物中，并且高度保守。泛素可由一系列酶催化连接至目标蛋白上，此过程被称为蛋白泛素化修饰，根据连接泛素数目的不同，可分为单泛素化和多泛素化修饰。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，可调控蛋白的稳定性、亚细胞定位、生物活性以及蛋白质间相互作用等。多种生理过程都有蛋白泛素化修饰的参与，如自噬、dna损伤修复、细胞凋亡、细胞周期调控、信号转导等。此外，蛋白的泛素化修饰还与多种人类疾病相关。

2、泛素化修饰蛋白及其修饰位点的鉴定是研究其功能的基础。目前，已有多项技术可用于泛素化修饰蛋白的富集，并可结合质谱技术对修饰位点进行鉴定。根据原理不同可分为三类：

3、（1）利用泛素亲和蛋白富集泛素化修饰蛋白。如通过tube（tandem ubiquitinbinding entities）富集泛素化修饰蛋白，但该技术对泛素化修饰类型具有选择性，只能识别多泛素化修饰蛋白。此外，该技术需在非变性条件下富集泛素化修饰蛋白，由于多泛素化修饰蛋白的不稳定性，在富集过程中蛋白降解不可避免，在非变性条件下还存在非特异性结合，导致假阳性结果产生。

4、（2）利用偶联标签的泛素蛋白富集泛素化修饰蛋白，如flag、myc、his和ha等标签，但这些方法中除了his标签可在变性条件下利用ni-nta富集之外，其他标签的富集均需要相应抗体在非变性条件下进行富集。此外，在生物体中有大量含有6×his的蛋白，则不可避免的导致假阳性结果产生。

5、（3）利用特异性抗体识别富集泛素化修饰蛋白，研究人员开发了特异性识别泛素化修饰蛋白被胰蛋白酶（trypsin）消化后在赖氨酸上遗留的二甘氨酸（lys-ε-gly-gly）的抗体，利用该抗体可以特异性富集被泛素化修饰的肽段。然而，该抗体不能区分泛素化修饰和类泛素化修饰，且抗体价格昂贵。

6、因此，开发一种不依赖于抗体，且可在变性条件下富集不同修饰类型的泛素化修饰蛋白的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白及其应用，该重组蛋白及方法能够在可变性的条件下且不依赖抗体的方式实现泛素化修饰蛋白的富集，富集效率高，非特异性富集少。

2、具体技术方案如下：

3、本发明提供了标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白，包括：邻近标记酶和泛素蛋白，所述邻近标记酶和泛素蛋白通过肽键偶联。

4、进一步地，所述重组蛋白还包括：蛋白标签；所述蛋白标签通过肽键与邻近标记酶的氨基端连接。

5、进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明还提供了如上所述重组蛋白的编码基因。

7、进一步地，所述的编码基因的碱基序列如seq id no.2所示。

8、本发明还提供了包含如上所述编码基因的重组表达载体或基因工程菌。

9、本发明还提供了如上所述重组蛋白，或者所述重组表达载体或基因工程菌，在标记植物泛素化修饰蛋白中的应用。

10、本发明还提供了一种标记植物泛素化修饰蛋白的方法，包括：

11、（1）采用基因工程手段，在目标生物体中表达如上所述重组蛋白；所述生物体为植物、植物组织或植物组织细胞；

12、（2）使用生物素处理目标生物体，进行植物泛素化修饰蛋白的标记，得到标记泛素化修饰蛋白的目标生物体。

13、本发明还提供了一种富集植物泛素化修饰蛋白的方法，包括：

14、（a）利用所述标记植物泛素化修饰蛋白的方法，获得标记泛素化修饰蛋白的目标生物体；

15、（b）提取目标生物体的总蛋白，沉淀生物素标记的泛素化修饰蛋白后，去除游离的生物素，再通过溶解的方式，获得含有生物素标记的泛素化修饰蛋白的溶液；

16、（c）利用生物素结合蛋白在步骤（b）的溶液中进行蛋白富集处理，再经洗涤和洗脱，得到生物素标记的泛素化修饰蛋白。

17、进一步地，步骤（1）中，表达重组蛋白的方式为：先构建含有重组蛋白编码基因的重组载体，导入至目标生物体中，使其在植物体细胞中表达。本发明中重组载体的原始表达载体为pkarbar1301:35s。也可为包含上述重组蛋白编码基因的pri101-an或pcambia1302等其他双元载体。

18、进一步地，步骤（2）中，将目标生物体浸泡在含有生物素的液体ms培养基中；所述生物素的浓度为180~220μm；优选地，所述生物素浓度为200 μm。

19、进一步地，步骤（b）中，采用变性蛋白提取缓冲液提取目标生物体的总蛋白；该变性蛋白提取缓冲液包含可使样品目标生物体中蛋白质变性的变性剂、缓冲液、蛋白酶抑制剂及去泛素酶抑制剂。优选地，变性剂为1%重量sds；缓冲液为ph 7.5的50 mm tris-hcl和150 mm nacl；蛋白酶抑制剂为complete protease inhibitor cocktail（roche）；去泛素酶抑制剂为5 mm nem。

20、进一步地，步骤（b）中，采用沉淀剂沉淀生物素标记的泛素化修饰蛋白；所述沉淀剂为预冷的丙酮。

21、进一步地，步骤（b）中，所述洗涤所采用的洗涤剂为80%丙酮，溶剂为水。

22、进一步地，步骤（b）中，所述溶解所采用的溶解缓冲液为20 mm tris-hcl ph 7.5，150 mm nacl，1% sds。溶解方法为，往沉淀中加入500 μl的溶解缓冲液，使用超声助溶，待沉淀溶解后，加入1500 μl的稀释缓冲液，使sds浓度降低至0.25%。所述稀释缓冲液为20 mmtris-hcl ph 7.5，150 mm nacl。

23、进一步地，步骤（c）中，生物素结合蛋白为streptavidin（链霉亲和素）。富集方法为：向步骤（b）所获得的含有生物素标记的泛素化修饰蛋白的溶液中加入200 μlstreptavidin mag beads（链霉亲和素磁珠），于4℃条件下孵育4 h。

24、进一步地，步骤（c）中，洗涤所采用的洗涤缓冲液为20 mm tris-hcl ph 7.5，500mm nacl，1% triton x-100，0.1% sds。洗涤方法为：利用磁力架吸附步骤（c）中加入的streptavidin mag beads，去除上清，加入2 ml洗涤缓冲液，于4℃条件下洗涤10 min，此步骤重复5次，最后去除上清。

25、进一步地，步骤（c）中，洗脱所采用的洗脱缓冲液为25 mm tris-hcl ph 6.8，2%(w/v) sds, 2% (v/v) glycerol, 4.4% (v/v) β-mercaptoethanol, 0.0005% (w/v)bromophenol blue。洗脱方法为：向步骤（c）洗涤后得到的吸附有蛋白的streptavidin magbeads中加入50 μl洗脱缓冲液，于95℃加热10 min。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、（1）本发明利用邻近标记酶偶联泛素蛋白的重组蛋白，对底物蛋白进行泛素化修饰，借助邻近标记酶的特点，对与泛素蛋白邻近的底物蛋白进行生物素化标记；该重组蛋白及配套方法可以在不依赖于抗体且可变性条件下富集不同修饰类型的泛素化修饰蛋白不具有选择性，大大降低了富集泛素化修饰蛋白的成本，且富集效率高，非特异性富集少。

28、（2）与采用抗体结合的方式相比，本发明富集方法先对泛素化修饰底物进行生物素化标记，再利用生物素结合蛋白进行富集，不仅成本低廉而且可耐受sds等变性剂，避免了非变性条件导致的泛素化修饰蛋白降解的情况发生。

29、（3）本发明方法操作简便，在富集泛素化修饰蛋白过程中不涉及酶切、变性复性等步骤。