一种凉粉草ISSR分子标记的引物组、反应体系及其在种质资源遗传多样性中的应用的制作方法

本发明属于分子生物，具体涉及一种凉粉草issr分子标记的引物组、反应体系及其在种质资源遗传多样性中的应用。

背景技术：

1、凉粉草(platostoma palustre(blume)a.j.paton)为唇形科、逐风草属植物，主要分布在我国浙江、广东、福建、广西、台湾等地区。凉粉草具有很高的营养和医药价值，是一种药食同源的植物，其茎叶富含多糖、黄酮等多种活性成分，且具有清利湿热、凉血解毒等功效，可用于制作龟苓膏、仙草冻和凉茶饮料等原料，其原料市场需求逐年增加。但目前凉粉草种植的品种较杂，在产量和品质上参差不齐。因此，开展凉粉草种质资源的综合评价，以筛选或选育优势品种，对凉粉草产业发展具有重要意义。

2、遗传多样性是生物学的核心之一，通过研究植物的遗传多样性，有助于对植物资源进行评价、选择、保存和利用。我国有着较为丰富的凉粉草种质资源，但近年的研究主要关注凉粉草的生物活性研究、化学成分鉴定和栽培技术等方面，关于凉粉草种质资源评价及筛选的相关研究报道较少。issr(inter-simple sequence repeat,简单重复间隔序列)标记是以pcr技术为基础的分子生物学技术，不但具有rapd标记的简便易行、快速方便等特点，还具有稳定性好、多态性高，揭示遗传多态性丰富等优点，目前在药用植物的遗传多样性、物种鉴别研究中多有应用。文章《不同仙草种源间遗传关系的issr分析》公开了采用issr分子标记技术对20份不同种源的仙草进行遗传多样性及亲缘关系的分析，以探讨仙草种源间的亲缘关系，其聚类结果表明仙草种源间的遗传差异与地理分布关系不密切而与形态差异有一定联系。

3、基于以上所述，本发明采用issr分子标记方法鉴定多个产地的凉粉草材料，以分析凉粉草不同种质凉粉草的亲缘关系，为凉粉草种质资源筛选及品种选育提供参考。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供一种凉粉草issr分子标记的引物组、反应体系及其在种质资源遗传多样性中的应用，通过采用issr分子标记方法对多个产地的多个凉粉草材料进行分析，以分析不同种质凉粉草的亲缘关系，为凉粉草种质资源筛选及品种选育提供参考。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种凉粉草issr分子标记的引物组，所述引物组的核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.10所示；

4、一种凉粉草issr分子标记的反应体系，每25μl的反应体系中含有dna模板40ng，10×bufer 2.5μl，如上所述的任一条引物0.3μmol/l，dntps 0.25μmol/l，mgcl2 1.5mmol/l，taqdna聚合酶1.25u。

5、进一步地，pcr扩增程序为：94℃预变性5min，然后进行35个循环：94℃变性45s，55～62℃复性45s，72℃延伸1.5min；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

6、一种如上所述的引物组或反应体系在凉粉草种质资源遗传多样性分析中的应用。

7、一种分析凉粉草种质资源遗传多样性的方法，包括以下步骤：提取凉粉草的基因组dna，采用如上所述的反应体系对提取获得的dna进行扩增，电泳分离，检测条带，利用以上所述的引物组将不同来源的凉粉草进行遗传聚类分析，计算凉粉草材料的遗传多样性参数。

8、进一步地，所述电泳分离的条件为：在2.0％的琼脂糖凝胶上检测，电压120v，电泳50min。

9、与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

10、1、本发明issr分子标记引物组和反应体系在凉粉草中扩增反应稳定，扩增片段清晰且重复性好，多态性高。利用本发明的引物组和反应体系对多个凉粉草种质资源进行鉴定，结果稳定可靠。本发明利用issr分子标记技术能很好的揭示不同产地的凉粉草种质的遗传多样性以及分辨凉粉草种质资源间的亲缘关系，对凉粉草种质资源筛选及品种选育具有重要意义。

11、2、本发明采用issr分子标记鉴定47份不同产地的凉粉草样品，分析不同种质的凉粉草的亲缘关系，种质数量多，样品丰富，来源广泛，遗传多样性丰富，分析结果准确率高，为凉粉草种质资源的进一步研究提供参考价值。

12、3、本发明从凉粉草的100条通用引物中筛选出10条多态性好、条带清晰、重复性高的引物用于pcr扩增，并结合本发明的pcr反应扩增体系和程序对不同种质的凉粉草的遗传多样进行精准分析，具有分析结果准确度高，遗传多样性分析快速等特点。

技术特征：

1.一种凉粉草issr分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如seqid no.1～seq id no.10所示。

2.一种凉粉草issr分子标记的反应体系，其特征在于，每25μl的反应体系中含有dna模板40ng，10×bufer 2.5μl，权利要求1所述的任一条引物0.3μmol/l，dntps0.25μmol/l，mgcl2 1.5mmol/l，taqdna聚合酶1.25u。

3.根据权利要求2所述的凉粉草issr分子标记的反应体系，其特征在于，pcr扩增程序为：94℃预变性5min，然后进行35个循环：94℃变性45s，55～62℃复性45s，72℃延伸1.5min；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

4.一种如权利要求1所述的引物组或权利要求2-3任一项所述的反应体系在凉粉草种质资源遗传多样性分析中的应用。

5.一种分析凉粉草种质资源遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取凉粉草的基因组dna，采用权利要求2-3任一项所述的反应体系对提取获得的dna进行扩增，电泳分离，检测条带，利用权利要求1所述的引物组将不同来源的凉粉草进行遗传聚类分析，计算凉粉草材料的遗传多样性参数。

6.根据权利要求5所述的分析凉粉草种质资源遗传多样性的方法，其特征在于，所述电泳分离的条件为：在2.0％的琼脂糖凝胶上检测，电压120v，电泳50min。

技术总结本发明公开一种凉粉草ISSR分子标记的引物组、反应体系及其在种质资源遗传多样性中的应用，属于分子生物技术领域。本发明提供的凉粉草ISSR分子标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示；用于凉粉草ISSR分子标记的反应体系为：每25μL的反应体系中含有DNA模板40ng，10×Bufer 2.5μL，引物0.3μmol/L，dNTPs 0.25μmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25U。本发明ISSR分子标记引物组和反应体系在凉粉草中扩增反应稳定，扩增片段清晰且重复性好，多态性高，利用本发明的引物组和反应体系对凉粉草种质资源进行鉴定，结果稳定可靠。本发明方法能很好的揭示凉粉草种质的遗传多样性以及分辨凉粉草种质资源间的亲缘关系，对凉粉草种质资源筛选及品种选育具有重要意义。技术研发人员：兰秀,李天元,黄若兰,陈会鲜,梁振华,黄珍玲,韦婉羚,杨海霞,李恒锐,何文,阮丽霞,蔡兆琴,赵春慧,马仙花,黄小娟,张秀芬,莫周美,郭素云受保护的技术使用者：广西南亚热带农业科学研究所技术研发日：技术公布日：2024/8/16